肺源性內(nèi)毒素對(duì)機(jī)械通氣肺損傷作用機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分大鼠肺源性內(nèi)毒素肺損傷模型的建立
　　 目的：觀察經(jīng)氣管滴入不同劑量?jī)?nèi)毒素對(duì)大鼠肺炎性改變的影響，探討肺源性內(nèi)毒素誘發(fā)肺損傷的病理生理變化，為后續(xù)研究提供依據(jù)。
　　 方法：清潔級(jí)成年雄性SD大鼠36只，隨機(jī)分為6組：對(duì)照組(C組，n=6)、50 μg/kg內(nèi)毒素組(L1組,n=6)、100 μg/kg內(nèi)毒素組(L2組,n=6)、200 μg/kg內(nèi)毒素組(L3組,n=6)、1000 μg/kg內(nèi)毒素組(L4組,

2、n=6)和5000 μg/kg內(nèi)毒素組(L5組,n=6)。
　　 內(nèi)毒素經(jīng)由氣管滴入，呼吸空氣。實(shí)驗(yàn)3小時(shí)結(jié)束，放血處死大鼠。測(cè)定大鼠肺損傷評(píng)分、肺組織濕/干重比(W/D)、支氣管灌洗液(BALF)白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血管透性系數(shù)。
　　 酶聯(lián)免疫分析法(ELISA法)測(cè)灌洗液里腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2(MIP-2)濃度。
　　 結(jié)果：肺損傷評(píng)分、W/D和血管透性系數(shù)：與C組比較，L1、L2和

3、L3組變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，L4和L5組各項(xiàng)指標(biāo)均升高(P＜0.05或P≤0.01)；與L4組比，L5組各項(xiàng)指標(biāo)升高均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P≤0.01)。肺灌洗液里WBC：與C組比較，L1和L2組變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，L3組升高(P＜0.05)，L4和L5組顯著升高(P＜0.01)。
　　 肺灌洗液里TNF-α濃度：R組沒(méi)檢測(cè)到，L1、L2、L3組測(cè)到少量，L4和L5組比L1增多有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。灌洗液里的MIP-2濃度：C、L1、

4、L2、L3組量很少，L4組升高，L5組明顯升高。
　　 結(jié)論：經(jīng)氣管滴入50-100 μg/kg LPS不會(huì)導(dǎo)致大鼠肺結(jié)構(gòu)損傷和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但能引起TNF-α輕度升高；經(jīng)氣管滴入200 μg/kg LPS不導(dǎo)致大鼠肺結(jié)構(gòu)損傷，但有輕度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和TNF-α輕度升高；經(jīng)氣管滴入1000和5000 μg/kg LPS則導(dǎo)致大鼠肺結(jié)構(gòu)損傷和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，伴有TNF-α和MIP-2升高，PO2降低。
　　 第二部分不同通氣方

5、式對(duì)大鼠肺及肺內(nèi)毒素受體CD14的影響
　　 目的：觀察不同的機(jī)械通氣方式對(duì)大鼠肺及肺內(nèi)毒素受體CD14的影響。
　　 方法：24只成年雄性SD大鼠采用3[％]戊巴比妥35-40mg/kg腹腔注射麻醉后，行氣管切開(kāi)并置入氣管導(dǎo)管固定，將之隨機(jī)分為4組(n=6)：自主呼吸組(R組)；機(jī)械通氣組(M組)，潮氣量(VT)=12ml/kg,呼氣末正壓(PEEP)=0mmHg；保護(hù)性機(jī)械通氣組(P組)，潮氣量VT=6ml/kg,呼

6、氣末正壓PEEP=8mmHg；大潮氣量機(jī)械通氣組(N組)，VT=40ml/kg，PEEP＝0 mmHg。吸呼比1：1，根據(jù)PETCO2和血?dú)饨Y(jié)果調(diào)整呼吸頻率(RR)。
　　 右頸動(dòng)脈置管測(cè)血壓并取血測(cè)血?dú)?，左股靜脈置管輸液給藥。分別于機(jī)械通氣前(基礎(chǔ)值)、機(jī)械通氣60、120、180min行動(dòng)脈血?dú)夥治?實(shí)驗(yàn)3小時(shí)結(jié)束，放血處死大鼠。
　　 測(cè)定大鼠肺損傷評(píng)分、肺組織濕/干重比(W/D)、支氣管灌洗液(BALF)炎性細(xì)胞

7、計(jì)數(shù)、血管透性系數(shù)(LPI)。酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)法測(cè)BALF里腫瘤壞死因子α(TNF-α),及巨噬細(xì)胞炎性蛋白2(MIP-2)濃度。RT-PCR測(cè)肺組織內(nèi)毒素受體CD14的表達(dá)，免疫組化法測(cè)肺組織的CD14表達(dá)。
　　 結(jié)果：肺損傷評(píng)分：R組和P組無(wú)變化，M組有輕度升高，N組比M組明顯升高(P<0.01)。
　　 肺W/D：與R組比較，P組和M組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；N組升高(p<0.01)。LPI：與R組比較，P組和

8、M組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；；N組明顯升高(P<0.01)。BALF中WBC：與P組無(wú)顯著變化，M組升高(P<0.05)，N組顯著升高(P<0.001)。TNF-α在四組都沒(méi)測(cè)到。MIP-2,與R組比較，P組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，M組升高(P<0.05)，N組明顯升高(P<0.01)。肺組織CD14基因和蛋白表達(dá)：與R組比較，P組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；M組蛋白表達(dá)差別無(wú)顯著意義，但基因表達(dá)升高；N組二者表達(dá)都顯著升高(P<0.01)。
　　

9、結(jié)論：常規(guī)機(jī)械通氣導(dǎo)致大鼠肺部發(fā)生輕度損傷，并可使肺部CD14基因表達(dá)上調(diào)，但是肺部CD14蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變；大潮氣量機(jī)械通氣導(dǎo)致大鼠肺部損傷，使肺部CD14表達(dá)明顯上調(diào)。保護(hù)性機(jī)械通氣可使大鼠肺部避免上述改變的發(fā)生。
　　 第三部分不同潮氣量機(jī)械通氣對(duì)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的影響
　　 目的：觀察不同潮氣量的機(jī)械通氣對(duì)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞CD14的影響。
　　 方法：清潔級(jí)成年雄性SD大鼠18只，隨機(jī)分為

10、3組：自主呼吸組(C組，n=6)，保護(hù)性機(jī)械通氣組(P組,n=6)，潮氣量(VT)=6ml/kg,呼氣末正壓(PEEP)=8mmHg；和大潮氣量機(jī)械通氣組(N組,n=6)，VT=40ml/kg，PEEP＝0 mmHg。吸呼比1：1，根據(jù)PETCO2和血?dú)饨Y(jié)果調(diào)整呼吸頻率(RR)。右頸動(dòng)脈置管測(cè)血壓并取血測(cè)血?dú)猓蠊伸o脈置管輸液給藥。分別于機(jī)械通氣前(基礎(chǔ)值)、機(jī)械通氣60、120、180min 行動(dòng)脈血?dú)夥治?實(shí)驗(yàn)3小時(shí)結(jié)束，放血處死大

11、鼠。測(cè)定大鼠肺損傷評(píng)分、肺組織濕/干重比(W/D)、支氣管灌洗液(BALF)炎性細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞(AM)計(jì)數(shù)、蛋白透性系數(shù)(LPI)。酶聯(lián)免疫分析法(ELISA法)測(cè)AM 培養(yǎng)液里單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)及巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2(MIP-2)濃度。RT-PCR測(cè)AM內(nèi)毒素受體CD14的表達(dá)，免疫組化法測(cè)AM上CD14表達(dá)。
　　 結(jié)果：肺損傷評(píng)分、W/D、BALF里WBC和AM、LPI、CD14基因和蛋白表達(dá)及培養(yǎng)液里MC

12、P-1和MIP-2濃度：與C組比較，P組無(wú)顯著改變，N組升高有顯著性差異(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：大潮氣量機(jī)械通氣大潮氣量機(jī)械通氣激活了肺泡巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞募集到肺泡并使肺泡巨噬細(xì)胞表達(dá)CD14上調(diào)；保護(hù)性機(jī)械通氣對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞無(wú)明顯影響。
　　 第四部分肺源性內(nèi)毒素對(duì)大鼠機(jī)械通氣肺損傷的影響及機(jī)制
　　 目的：觀察經(jīng)氣管滴入LPS對(duì)機(jī)械通氣大鼠肺損傷的影響并探討其可能機(jī)制。
　　 方法：成年

13、雄性SD大鼠24只，隨機(jī)分為自然呼吸組(C組,n=6)、內(nèi)毒素加自然呼吸組(C1組,n=6)、機(jī)械通氣組(M組,n=6)和內(nèi)毒素加機(jī)械通氣組(M1組,n=6)。C1組和M1組經(jīng)氣管滴入100 μg/kg LPS，M組和M1組接小動(dòng)物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣。呼吸參數(shù)設(shè)定：潮氣量(VT)=20ml/kg,PEEP=0mmHg，吸/呼為1：1，調(diào)節(jié)呼吸頻率(RR)使PETCO2維持在35-45mmHg。C組和C1組保持自主呼吸。四組都吸入空氣。監(jiān)測(cè)

14、動(dòng)物血壓、心率、心電圖和PET CO2。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始、60min、120min和180min測(cè)血?dú)?。整個(gè)實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作。實(shí)驗(yàn)3h結(jié)束，放血處死大鼠。測(cè)定大鼠肺損傷評(píng)分、肺組織濕/干重比(W/D)、支氣管灌洗液(BALF)炎性細(xì)胞數(shù)和肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)(AM)、肺蛋白透性系數(shù)。酶聯(lián)免疫分析法(ELISA法)測(cè)BALF里腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2(MIP-2)濃度。RT-PCR法測(cè)肺組織內(nèi)毒素受體CD14 mRNA的

15、表達(dá)，免疫組化法測(cè)BALF里巨噬細(xì)胞的CD14表達(dá)。
　　 結(jié)果：肺W/D和肺蛋白透性系數(shù)：與C組比，C1組和M組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，M1組升高(P<0.01)；與M組比，M1組升高(P<0.01)。BALF中WBC和AM、病理學(xué)積分和MIP-2：與C組比，C1組無(wú)明顯改變，M組和M1組升高(P<0.01)；與M組比，M1組升高(P<0.01)。TNF-α：C組和M組未檢測(cè)到，C1組和M1組升高，M1組比C1組升高更顯