小瓜蟲(chóng)體外培養(yǎng)研究及青蒿琥酯等藥物對(duì)小瓜蟲(chóng)的影響.pdf

1、多子小瓜蟲(chóng)(Ichthyophthirius multifiliis)是一種世界性分布的淡水魚(yú)類(lèi)寄生蟲(chóng)，在高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖中引起魚(yú)類(lèi)暴發(fā)性感染，可導(dǎo)致大批魚(yú)死亡，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。為了有效控制小瓜蟲(chóng)病的發(fā)生，研究小瓜蟲(chóng)的體外培養(yǎng)及其基因檢測(cè)，得到如下結(jié)果： 1、體外培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)：采用含犢牛血清的EMEM(Eagle’S Minimum EssentialMedium)液體培養(yǎng)基、含鰻魚(yú)血清的EMEM液體培養(yǎng)基、含犢牛血清的RPM

2、l1640培養(yǎng)基、含鰻魚(yú)血清的RPMl1640培養(yǎng)基四種培養(yǎng)基，分別按照1:1、1:2、1:3、1：4、1:5、1：6比例稀釋，對(duì)小瓜蟲(chóng)的幼蟲(chóng)進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察其存活情況并對(duì)蟲(chóng)體個(gè)體大小進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：以含鰻魚(yú)血清的EMEM液體培養(yǎng)基效果最好，蟲(chóng)體存活時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)22d，其最優(yōu)的稀釋度為1:1的培養(yǎng)基，蟲(chóng)體的平均直徑可達(dá)30.17±2.05μm，個(gè)體顯著大于其他稀釋度組．(P<0.05)。 2、小瓜蟲(chóng)體外培養(yǎng)生長(zhǎng)情況觀察：合適

3、的培養(yǎng)基和準(zhǔn)確地計(jì)數(shù)對(duì)于評(píng)價(jià)藥物抗小瓜蟲(chóng)的效果是非常必要的，常用的計(jì)數(shù)蟲(chóng)體數(shù)目的方法有血球計(jì)數(shù)板法、MTT法和CBB法。本研究通過(guò)篩選的適宜小瓜蟲(chóng)生長(zhǎng)的恰當(dāng)培養(yǎng)基和較準(zhǔn)確的計(jì)數(shù)方法，來(lái)進(jìn)一步研究小瓜蟲(chóng)體外生長(zhǎng)情況。實(shí)驗(yàn)確定了能比較準(zhǔn)確計(jì)數(shù)體外培養(yǎng)的小瓜蟲(chóng)的計(jì)數(shù)方法一MTT法，并且通過(guò)準(zhǔn)確的計(jì)數(shù)方法確定了在較優(yōu)培養(yǎng)基中小瓜蟲(chóng)的生長(zhǎng)高峰期是接種后的第8d，其增值倍數(shù)可達(dá)7.6倍。 3、青蒿琥酯等藥物對(duì)離體培養(yǎng)小瓜蟲(chóng)的作用：運(yùn)用篩選出

4、的培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用青蒿琥酯和磷酸氯喹以不同的濃度處理體外培養(yǎng)的小瓜蟲(chóng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明青蒿琥酯和磷酸氯喹對(duì)體外培養(yǎng)的小瓜蟲(chóng)均有抑制效果，青蒿琥酯24h、48h、96h的LC<,50>分別為1.7mg/ml、1.4mg/ml、1.08mg/ml，磷酸氯喹24h、48h、96h的LC<,50>分別為0.0051mg/ml、0.0035mg/ml、0.0024mg/ml。磷酸氯喹抗體外小瓜蟲(chóng)的效果明顯比青蒿琥酯好。青蒿琥酯通過(guò)破壞膜系結(jié)構(gòu)

5、，使小瓜蟲(chóng)的Na<'+>K<'+>ATP酶、SOD、GSH-PX,CAT的活性降低，MDA含量增加，從而對(duì)小瓜蟲(chóng)有抑制作用。磷酸氯喹聚集于小瓜蟲(chóng)食物泡內(nèi)使蟲(chóng)體pH值升高，破壞了膜結(jié)構(gòu)，使小瓜蟲(chóng)的Na<'+>K<'+>ATP酶、GSH-PX的活性下降，SOD活力、CAT活力，MDA含量上升，起到殺蟲(chóng)的效果。 4、小瓜蟲(chóng)的18SrRNA基因的PCR分析：通過(guò)對(duì)小瓜蟲(chóng)的DNA提取及18SrRNA基因序列擴(kuò)增方法進(jìn)行研究，結(jié)果表明：體外