維甲酸和刺猬因子促進骨髓基質細胞向運動神經元發(fā)育的實驗研究.pdf

1、本實驗共分為兩部分研究維甲酸(RA)和刺猬因子(Shh)單獨和聯合誘導對促進骨髓基質細胞(BMSCs)向運動神經元(MN)發(fā)育的作用。第一部分使用本實驗室制神經干細胞培養(yǎng)基(專利號：ZL02134314.4)培養(yǎng)骨髓基質細胞(BMSCs)，掌握BMSCs的原代培養(yǎng)和純化方法，觀察細胞生長、發(fā)育和分化情況，并通過檢測神經干細胞標記Nestin和MN發(fā)育過程重要標記蛋白Hb9，研究了BMSCs的增殖、分化生物學特點。第二部分研究依誘導劑不同

2、分四組(空白組、RA組、Shh組和RA+Shh組)誘導BMSCs，觀察骨髓源性神經干細胞(BMSCs-D-NSCs)的生長增殖及分化情況，檢測Nestin和Hb9標記表達，并結合發(fā)育神經生物學的知識探討B(tài)MSCs-D-NSCs進一步分化為運動神經元的潛力。 第一章小鼠骨髓基質細胞的培養(yǎng)及生物學特性觀察 目的 研究BMSCs取材、原代培養(yǎng)方法，觀察細胞在特制培養(yǎng)基的生長、增殖和形態(tài)變化狀況，掌握BMSCs-D-NS

3、Cs體外培養(yǎng)要點和生長生物學特性，獲得穩(wěn)定純化的BMSCs-D-NSCs，為后續(xù)誘導分化實驗奠定基礎。 方法 1、小鼠骨髓基質細胞的原代培養(yǎng)：麻醉5～7周新西蘭小鼠，使用注射器以5ml培養(yǎng)基無菌沖洗出股骨和脛骨骨髓細胞，以Ficoll-Paque液(相對密度1.077)梯度密度離心法獲取有核細胞層接種。使用本實驗室制神經干細胞培養(yǎng)液(專利號：ZL02134314.4)培養(yǎng)，加入10％胎牛血清，首次24h后換液，以后每三天

4、換液； 2、小鼠骨髓基質細胞的傳代培養(yǎng)：培養(yǎng)6天后0.125％胰酶消化使貼壁細胞脫落，收集細胞懸液離心后接種傳代； 3、相差顯微鏡下觀察原代及傳代細胞生長狀況； 4、Nestin和Hb9免疫細胞化學檢測：在傳代培養(yǎng)后第8、12、16、20天，以Nestin(1∶200，神經干細胞相對特異性標記抗體)和Hb9(1∶500，運動神經元特異性標記抗體)為檢測指標，依改良SABC法和間接免疫熒光法對傳代培養(yǎng)細胞進行免疫細

5、胞化學檢測。 結果 1、BMSCs初接種在培養(yǎng)孔中呈散在圓形細胞，接種24h后，可見大部分細胞已貼壁，48～72h后細胞貼壁緊密，細胞整體體積明顯增大，部分細胞向梭型和多角型發(fā)展，胞漿豐富。培養(yǎng)第6天進行細胞傳代，此時貼壁細胞被胰酶消化后重新呈散在圓形細胞，部分成團，胞體直徑比接種初大約1～2倍。傳代接種后的細胞立體感增強，并可見胞體收縮成錐形或球形；在傳代后，部分細胞伸出較細長突起，但仍有部分細胞呈圓形。在培養(yǎng)后期(第

6、20天)，細胞由以圓形為主轉變?yōu)橐酝黄鸺毎麨橹鳌?2、Nestin檢測到少量細胞陽性，陽性率＜4％，Hb9熒光表達陰性。 結論 密度離心法結合貼壁法可獲得形態(tài)較為純一的BMSCs，細胞生長穩(wěn)定，增殖分化能力良好。在所檢測時間點上，Nestin陽性細胞＜4％，推斷沒有或只有極少數BMSCs-D-NSCs生成。雖有細胞分化、但尚未發(fā)現Hb9陽性表達細胞，提示生成的多突起細胞不具有運動神經元的特性。 第二章RA

7、和Shh促進小鼠骨髓基質細胞向運動神經元發(fā)育的實驗研究 目的 研究維甲酸(RA)和刺猬因子(Shh)單獨和聯合作用對促進小鼠骨髓基質細胞(BMSCs)向運動神經元(MN)發(fā)育的作用。 方法 1、BMSCs的原代培養(yǎng)：麻醉5～7周新西蘭小鼠，無菌沖洗出股骨和脛骨骨髓細胞，使用Ficoll-Paque液(相對密度1.077)分離取有核細胞層接種。使用本實驗室自制神經干細胞培養(yǎng)液(專利號：ZL02134314.

8、4)培養(yǎng)，加入10％胎牛血清，依實驗分組分別加入不同誘導劑：①空白對照組；②RA組：加入0.5ug/mlRA；③Shh組：加入200ng/mlShh因子；④RA+Shh組：加入0.5ug/mlRA和200ng/mlShh。在37℃、5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，24h后首次換液，以后每3天換液； 2、BMSCs的傳代培養(yǎng)：培養(yǎng)6天后0.125％胰酶消化使貼壁細胞脫落，吹打收集細胞懸液離心后接種傳代； 3、相差顯微鏡下觀

9、察原代及傳代細胞生長狀況； 4、Nestin和Hb9免疫細胞化學檢測：在培養(yǎng)后第8、12、16、20天，以Nestin(1∶200，神經干細胞相對特異性標記抗體)和Hb9(1∶500，運動神經元特異性標記抗體)為檢測指標，依改良SABC法和間接免疫熒光法對傳代培養(yǎng)細胞進行免疫細胞化學檢測。 5、倒置顯微鏡或熒光顯微鏡下觀察細胞。每組選取6個細胞密度適中的視野，計算Nestin陽性(或Hb9陽性)細胞數N1和一個視野內細胞

10、總數N2，計算各陽性細胞占視野總細胞百分比R=N1/N2×100％，采用42析因設計分析四個實驗分組在四個時間點的差別。控制單效應下采用One—WayANOVA對比組間數據，兩兩比較使用秩和檢驗法，顯著性標準為P＜0.05。 結果vRA組Nestin陽性表達率比其他三組都高(P=0.000)，最高表達可達80％。Shh組和對照組的Nestin表達陽性率均很低(＜4％)，兩者間無顯著差別(P=0.885)；RA+Shh組的Nest

11、in陽性細胞百分比最高不大于40％，和對照組比較有差別(P=0.000)。四組中只有RA+Shh組Hb9表達陽性，其他組均未檢測到Hb9抗體。 結論 1、RA可促進骨髓基質細胞向骨髓源性神經干細胞轉化，提高骨髓源性神經干細胞Nestin陽性表達；單獨使用Shh沒有明顯促進BMSCs向神經干細胞方向轉化； 2、在RA誘導的基礎上，使用Shh可以誘導骨髓源性神經干細胞進一步表達運動神經元在發(fā)育過程中的重要蛋白Hb9，