枸杞子提取物在病理模型中的探索性研究.pdf

1、枸杞子是茄科植物寧夏枸杞的成熟干燥果實(shí)，為我國(guó)常用中藥。枸杞成分復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)成分明確的枸杞子提取液LBA及枸杞多糖LBP，在常見(jiàn)臨床病理模型:視網(wǎng)膜缺血、視網(wǎng)膜神經(jīng)變性RCS大鼠及糖尿病胃癱模型中，探索其藥理學(xué)作用，為枸杞的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和新藥思路。
　　第一部分、枸杞子提取液在視網(wǎng)膜缺血模型中的研究
　　目的:觀察枸杞子提取液(LBA)對(duì)視網(wǎng)膜缺血的防治作用并探索其與細(xì)胞凋亡的相關(guān)聯(lián)系。
　　材料與方法

2、:建立前房加壓誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜缺血模型，將36只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分組，正常組4只，生理鹽水組（NS組）16只，LBA組16只。LBA組及NS組于模型制作前28天分別連續(xù)經(jīng)口喂食LBA(1 mg/kg)及等量生理鹽水(NS)，LBA組及NS組根據(jù)灌注時(shí)間的不同，再分為灌注后12h、24h、48h及72h四組。采用HE染色和TUNEL法檢測(cè)，觀察LBA組及NS組視網(wǎng)膜中各層神經(jīng)元的變化，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Fas/FasL蛋白的

3、表達(dá)探索其與細(xì)胞凋亡的聯(lián)系。
　　結(jié)果:
　　(1)HE染色:NS組大鼠內(nèi)核層缺血再灌注12小時(shí)之后厚度輕微變薄，細(xì)胞數(shù)略微減少，此時(shí)內(nèi)網(wǎng)層、外網(wǎng)層及外核層變化不大。24小時(shí)后，外網(wǎng)層變薄，外核層變化輕微，內(nèi)核層結(jié)構(gòu)層次紊亂，視網(wǎng)膜以節(jié)細(xì)胞數(shù)減少最為顯著。48小時(shí)后，各層厚度變薄程度逐漸更加明顯，以內(nèi)核層最為顯著，細(xì)胞數(shù)大量減少。72小時(shí)后，各層細(xì)胞進(jìn)一步變薄。與NS組相比，不同時(shí)間點(diǎn)LBA組大鼠內(nèi)核層至內(nèi)界膜厚度，均超過(guò)N

4、S組(P＜0.01)，內(nèi)核層細(xì)胞數(shù)和節(jié)細(xì)胞數(shù)比NS組多，細(xì)胞形態(tài)及排列也比較規(guī)整。
　　(2) TUNEL檢測(cè):正常鼠無(wú)細(xì)胞凋亡表現(xiàn)，TUNEL染色呈陰性反應(yīng)。12小時(shí)后生理鹽水組內(nèi)核層與視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層均可觀察到TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，到24hTUNEL陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，內(nèi)核層最為明顯，而外核層無(wú)明顯的細(xì)胞凋亡征象。24h開(kāi)始TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞逐漸減少，到72h時(shí)凋亡細(xì)胞只有3～6個(gè)/100μm。LBA組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)規(guī)律與鹽

5、水對(duì)照組類(lèi)似，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞在12、24、48h比生理鹽水組有顯著減少。
　　(3) Fas/FasL染色:正常鼠不表達(dá)Fas/FasL陽(yáng)性細(xì)胞。12小時(shí)后生理鹽水組內(nèi)核層與視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層均可觀察到Fas的少量表達(dá);到24h后Fas陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，內(nèi)核層最為明顯。到72h后Fas陽(yáng)性細(xì)數(shù)明顯減少。LBA組Fas陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)規(guī)律與鹽水對(duì)照組類(lèi)似，F(xiàn)as陽(yáng)性細(xì)胞細(xì)胞在各個(gè)時(shí)間段比生理鹽水組均有顯著減少。FasL的表達(dá)表達(dá)規(guī)律早期

6、與Fas及TUNEL染色表達(dá)規(guī)律均相似，12小時(shí)后生理鹽水組內(nèi)核層與視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層均可觀察到FasL的少量表達(dá)，24h后FasL陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，達(dá)到高峰，以后逐漸下降但72h后仍維持高表達(dá)。LBA組FasL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在各個(gè)時(shí)間段比生理鹽水組均有顯著減少。
　　結(jié)論:
　　(1)視網(wǎng)膜缺血模型前28天連續(xù)經(jīng)口喂食LBA1 mg/kg，可以有效保護(hù)大鼠視網(wǎng)膜，內(nèi)核層變薄程度顯著降低，各層細(xì)胞數(shù)比對(duì)照組也顯著增加。
　　(

7、2)細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷原因之一，大鼠經(jīng)口喂食LBA可以顯著降低此類(lèi)凋亡。
　　(3) Fas/FasL凋亡信號(hào)系統(tǒng)的參與是造成視網(wǎng)膜神經(jīng)元損傷的機(jī)理之一，LBA通過(guò)有效降低Fas/FasL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，達(dá)到保護(hù)視網(wǎng)膜缺血損傷的作用。
　　第二部分、枸杞子提取液對(duì)RCS大鼠視網(wǎng)膜的探索性研究
　　目的:觀察枸杞子提取液(LBA)對(duì)RCS大鼠視網(wǎng)膜色素變性的治療作用。
　　方法:RCS大鼠60只，隨機(jī)分

8、為給藥組和對(duì)照組各30只。給藥組大鼠出生后第10天開(kāi)始喂食LBA(1 mg/kg)，對(duì)照組大鼠喂食等量生理鹽水。兩組大鼠分別在生后25、35、50d處死，取出眼球，制備組織切片，HE染色和TUNEL檢測(cè)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的數(shù)量，Caspase-2染色檢測(cè)LBA對(duì)細(xì)胞凋亡的作用。
　　結(jié)果:給藥組大鼠出生25d時(shí)，感光細(xì)胞數(shù)目比對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目多;35d時(shí)，感光細(xì)胞數(shù)目較25d時(shí)有所下降;50d時(shí)感光細(xì)胞數(shù)目與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異。LBA

9、組在第25天陽(yáng)性感光細(xì)胞明顯多于對(duì)照組。RCS大鼠給藥組25d時(shí)TUNEL檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目與對(duì)照組相比明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。RCS大鼠LBA組在25天和35天時(shí)Caspase-2陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于內(nèi)核層及節(jié)細(xì)胞層，實(shí)驗(yàn)組第25天陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為7.14±1.86，明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)，之后兩組差別逐漸變小，到第50天，兩組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)差別不大。
　　結(jié)論:在RCS大鼠視網(wǎng)膜變性的早期，LBA可以使感光細(xì)

10、胞得到更多存留，對(duì)早期變性的神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用。LBA對(duì)凋亡的抑制作用可能與抑制Caspase-2蛋白表達(dá)有關(guān)。
　　第三部分、LBP對(duì)大鼠糖尿病胃癱模型血糖及胃動(dòng)力研究
　　目的:本實(shí)驗(yàn)采用枸杞多糖(LBP)對(duì)糖尿病大鼠模型并發(fā)癥胃癱進(jìn)行探索性研究，希冀為糖尿病胃癱的臨床治療提供依據(jù)和新的治療方法。
　　材料與方法:本實(shí)驗(yàn)中，LBP的口服劑量分為三組，每天100，200 and400 mg/kg，實(shí)驗(yàn)前提前連續(xù)喂食2

11、8天后，建立鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠病理模型，測(cè)量血液中葡萄糖、胰島素含量及胰島素抵抗指數(shù)(IRI)、Ghrelin、Ghrelin mRNA、胃排空率、凋亡指數(shù)(AI)及Bcl-2/Bax比值，并進(jìn)行相應(yīng)的分析。
　　結(jié)果:LBP顯著降低葡萄糖、胰島素及IRI水平(P＜0.05)。Ghrelin在LBP給藥后顯著升高，呈劑量依賴性(P＜0.05)。糖尿病大鼠Ghrelin mRNA在胃粘膜表達(dá)增加，但在LBP給藥后顯著降低(P