O-甘露聚糖和甘露戊糖的高效合成研究.pdf

1、細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)復(fù)雜的糖鏈在生物體內(nèi)多種生理和病理過程中扮演著重要角色。然而，由于自然界中糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性很難通過天然提取分離的手段獲得足夠量、高純度的生物活性寡糖及其綴合物，因而糖鏈樣品的來源成為制約糖結(jié)構(gòu)和功能研究的一大瓶頸。而采用化學(xué)法和酶法進(jìn)行體外寡糖合成則為糖鏈的獲得提供了嶄新的途徑，是近年來糖科學(xué)研究的難點(diǎn)、熱點(diǎn)和前沿領(lǐng)域。本論文以解決兩類生物活性寡糖的來源性問題為目標(biāo)，主要完成了兩部分工作:1.完成了6個(gè)Core M1 O-甘露

2、聚糖（O-mannose glycans）分子的化學(xué)酶法合成;2.完成了1個(gè)非對稱3，6-分支甘露戊糖(Man5)的化學(xué)合成。
　　1 Core M1 O-甘露聚糖的化學(xué)酶法合成
　　O-甘露聚糖因其豐富的結(jié)構(gòu)多樣性和重要的生物學(xué)功能已成為近年來糖生物學(xué)研究的新熱點(diǎn)和前沿領(lǐng)域。肌營養(yǎng)不良相關(guān)蛋白聚糖(α-dystroglycan，α-DG)表面的O-甘露聚糖能夠與肌細(xì)胞外基質(zhì)分子相結(jié)合以維持抗肌萎縮蛋白-糖蛋白復(fù)合物（dys

3、trophin-glycoprotein complex，DGC）的正常結(jié)構(gòu)和功能。因糖鏈生物合成途徑異常而造成的α-DG表面O-甘露聚糖低表達(dá)，會(huì)引起各種類型先天性肌營養(yǎng)不良(congenital muscular dystrophies，CMDs)。此外，O-甘露聚糖還與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和某些病毒對宿主細(xì)胞的入侵有密切關(guān)系。然而目前，O-甘露聚糖的生物合成途徑及其與細(xì)胞外基質(zhì)分子間相互作用的構(gòu)效關(guān)系尚不十分清楚。要解決這些問題，首先就要

4、獲得足夠量高純度的O-甘露聚糖分子探針，結(jié)合糖的微陣列技術(shù)以發(fā)現(xiàn)生物合成途徑中的相關(guān)酶類并揭示其催化機(jī)制，并在分子水平上深入研究這些糖鏈與細(xì)胞外基質(zhì)分子間相互作用的機(jī)制。
　　然而，由于立體選擇性構(gòu)建O-甘露聚糖結(jié)構(gòu)中的唾液酸和巖藻糖糖苷鍵的挑戰(zhàn)性，加之O-甘露聚糖結(jié)構(gòu)的高度多樣性，O-甘露聚糖的合成研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其生物活性研究:(1)已發(fā)展的策略均以某一個(gè)糖鏈結(jié)構(gòu)為目標(biāo)分子，且僅實(shí)現(xiàn)了O-甘露聚糖中2個(gè)結(jié)構(gòu)（一個(gè)Core M1

5、四糖和一個(gè)Core M3三糖）的合成;(2)已發(fā)展的化學(xué)合成策略存在路線冗長、糖苷化反應(yīng)選擇性低、工作量大而總收率低等多種弊端，已報(bào)道的酶法合成也多受限于所采用的哺乳動(dòng)物酶的催化效率低、可溶性表達(dá)量低、底物適應(yīng)性差等缺陷;(3)對于Core M1系列中更為復(fù)雜的含有N-羥乙酰神經(jīng)氨酸化的N-乙酰乳糖胺(sLNGc)、路易斯X(Lewis x，Lex)和唾液酸化路易斯X(sialyl Lewis x，sLex)單元的四糖和五糖分子則尚未實(shí)

6、現(xiàn)任何形式的合成。因此，急需發(fā)展一種能夠覆蓋盡可能多的該系列寡糖結(jié)構(gòu)的多樣化導(dǎo)向的高效合成策略。
　　針對上述問題，本論文發(fā)展了一個(gè)多樣化導(dǎo)向的基于連續(xù)“一鍋多酶”(one-pot multi-enzyme，OPME)糖苷化的Core M1 O-甘露聚糖化學(xué)酶法合成策略，主要開展了以下幾方面工作:
　　(1) CoreM1 O-甘露二糖氨基酸的化學(xué)法合成
　　采用基于丁二酮、叔丁基二甲基硅基的保護(hù)基策略和兩步高效的化學(xué)

7、糖苷化反應(yīng)，靈活高效地合成了末端連有絲氨酸的Core M1 O-甘露聚糖核心二糖。
　　(2) Core M1 O-甘露聚糖糖鏈的酶法延伸
　　以化學(xué)合成的Core M1 O-甘露二糖絲氨酸為起始底物，將三個(gè)細(xì)菌來源的分別用于β1-4半乳糖苷鍵、α2-3唾液酸糖苷鍵、α1-3巖藻糖苷鍵構(gòu)建的“一鍋多酶”糖苷化體系用于Core M1 O-甘露聚糖糖鏈的仿生化延伸，并合理調(diào)整酶催化反應(yīng)順序，實(shí)現(xiàn)了Core M1 O-甘露聚糖分子

8、的多樣化合成。
　　最終以每步酶反應(yīng)70％以上的收率首次實(shí)現(xiàn)了6個(gè)末端連有絲氨酸的CoreM1 O-甘露聚糖的高效、大量合成，其中包括含有sLNGc、Lex、sLC單元的復(fù)雜Core M1 O-甘露四糖和五糖的首次全合成。
　　2非對稱3，6-分支甘露戊糖(Man5)的化學(xué)合成
　　Man5是寡聚甘露糖和復(fù)雜型N-聚糖所共有的核心結(jié)構(gòu)，也是HIV-1包膜糖蛋白gp120表面糖鏈中含量最為豐富的結(jié)構(gòu)。大量證據(jù)表明，Man

9、5結(jié)構(gòu)域是HIV人單克隆抗體2G12的識別位點(diǎn)，也是可與HIV包膜結(jié)合的凝集素cyanovirin-N(CVN)的最初結(jié)合靶點(diǎn)。因而以Man5為基礎(chǔ)構(gòu)建成簇抗原表位是抗HIV糖疫苗研究的熱點(diǎn)，且gp120寡聚甘露糖與受體相互作用的研究也需要大量高純度Man5樣品。
　　然而，目前寡聚甘露糖的制備多采用化學(xué)合成，且多集中在線性結(jié)構(gòu)和對稱的分支結(jié)構(gòu)上，對此非對稱分支Man5尚未發(fā)展出非常高效的合成方法。
　　針對上述問題，本論文

10、發(fā)展了一個(gè)由三個(gè)砌塊組成的基于連續(xù)區(qū)域選擇性糖苷化的一鍋法合成策略，開展了以下工作:(1)合理設(shè)計(jì)并高效合成了三個(gè)甘露糖砌塊;(2)從三個(gè)砌塊出發(fā)，采用分步法優(yōu)化了兩步區(qū)域選擇性糖苷化合成全保護(hù)Man5的條件;(3)基于分步法確定的糖苷化反應(yīng)條件，以相同的三個(gè)砌塊采用一鍋法以61％的總收率合成了Man5，且該收率遠(yuǎn)高于上述分步法38％的總收率。
　　3總結(jié)和創(chuàng)新點(diǎn)
　　本論文解決了兩類生物活性寡糖特別是Core M1 O-甘

11、露聚糖的大量獲得性問題，為具有類似結(jié)構(gòu)的寡糖分子的合成提供了新的思路，也為后續(xù)相關(guān)生物學(xué)研究及未來相應(yīng)疾病的診斷治療奠定了基礎(chǔ)。主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)如下:
　　(1)首次發(fā)展了一個(gè)基于丁二酮、叔丁基二甲基硅基和兩步高效的化學(xué)糖苷化反應(yīng)的Core M1 O-甘露二糖絲氨酸砌塊化學(xué)合成策略;
　　(2)首次發(fā)展了一個(gè)基于細(xì)菌來源“一鍋多酶”糖苷化體系的多樣化導(dǎo)向的Core M1 O-甘露聚糖化學(xué)酶法合成策略;
　　(3)首次實(shí)現(xiàn)了6