番茄GDP-L-半乳糖磷酸酶基因SlGGP-LIKE的功能分析.pdf

1、番茄起源于熱帶，是喜溫類蔬菜，因此當(dāng)氣溫較低時，番茄生長發(fā)育遲緩，影響莖、葉生長，長時間的低溫環(huán)境則會導(dǎo)致植株死亡。同時，低溫影響根系對磷、鈣、鉀、鎂等營養(yǎng)元素的吸收和利用，使葉片黃化加劇。低溫條件會導(dǎo)致細(xì)胞膜透性降低，活性氧增加，酶系功能改變，引起細(xì)胞代謝的變化和功能紊亂，發(fā)生低溫生理傷害?？箟难幔ˋscorbic acid，AsA）又叫維生素C（Vitamin C，Vc），是一種水溶性抗氧化有機(jī)小分子,在植物中廣泛存在,參與體內(nèi)活

2、性氧清除，調(diào)控細(xì)胞分裂和細(xì)胞生長,并可作為某些氧化還原酶的輔酶參與多種生理過程。在人體內(nèi)，抗壞血酸是高效的抗氧化劑，可以保護(hù)身體免于自由基的威脅，維持免疫功能，提高免疫力。另外，在環(huán)境變化時，番茄極易染病，導(dǎo)致番茄植株萎蔫，黃化矮縮，嚴(yán)重時會造成番茄果實(shí)大面積腐爛，從而導(dǎo)致作物減產(chǎn)。
　　GDP-L-半乳糖磷酸酶（GGP）是植物抗壞血酸 L-半乳糖途徑合成的關(guān)鍵酶之一。近幾年來在植物衰老和逆境脅迫研究中，抗壞血酸作為生物體內(nèi)對自由

3、基傷害產(chǎn)生的相應(yīng)保護(hù)系統(tǒng)成員之一，更引起了人們的研究興趣。因此，研究番茄GGP基因的功能，具有重要的科學(xué)意義。
　　本研究從番茄中克隆了一個細(xì)胞核定位的抗壞血酸合成基因（SlGGP-LIKE），并以轉(zhuǎn)反義SlGGP-LIKE的番茄和過表達(dá)SlGGP-LIKE的煙草為材料，探討了SlGGP-LIKE基因在耐低溫、病原菌和氧化脅迫等方面的功能。主要結(jié)果如下：
　　（1）從番茄葉片中分離得到SlGGP-LIKE基因（GenBank

4、序列號：XM_004231938.2），該基因全長為2092bp，開放閱讀框?yàn)?317bp，編碼438個氨基酸，具有兩個保守區(qū)-HIT（histidine triad）序列和NLS（nuclear localization sequence）序列。預(yù)測分子量為49kDa，該基因位于番茄2號染色體上。
　　（2）RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)，SlGGP-LIKE在番茄的根、莖、葉、花和果實(shí)中均有表達(dá)，其中，該基因在葉片中的表達(dá)量最高。同時

5、，低溫、MV、強(qiáng)光、NaCl、SA和病原菌均可誘導(dǎo)SlGGP-LIKE表達(dá)。
　?。?）構(gòu)建SlGGP-LIKE-GFP融合蛋白并瞬時轉(zhuǎn)化本生煙幼苗，通過Confocal觀察發(fā)現(xiàn)SlGGP-LIKE蛋白定位于細(xì)胞核。
　?。?）構(gòu)建了 pET-SlGGP-LIKE原核表達(dá)載體，在大腸桿菌 BL21中成功誘導(dǎo)SlGGP-LIKE蛋白表達(dá)，制備抗體，效價為1:300，并用于Western blot實(shí)驗(yàn)。（5）將SlGGP-LIK

6、E基因的編碼區(qū)連入含有35S啟動子的pBI121載體，重組構(gòu)建了SlGGP-LIKE的過表達(dá)和抑制表達(dá)載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化番茄和煙草，獲得反義轉(zhuǎn)基因番茄植株和過表達(dá)SlGGP-LIKE的煙草植株。通過PCR、RT-qPCR以及Western雜交的方法對得到的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測，結(jié)果表明成功獲得了 SlGGP-LIKE過表達(dá)和抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因番茄植株和轉(zhuǎn)基因煙草植株。通過進(jìn)一步對轉(zhuǎn)基因植株的檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)反義番茄AsA含量與野生

7、型番茄相比明顯下降，轉(zhuǎn)正義煙草AsA含量升高了將近兩倍。
　?。?）通過檢測反義株系抗壞血酸合成途徑（L-半乳糖途徑）中其他相關(guān)酶基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)位于 SlGGP-LIKE上游的基因，如 GPI和 GME基因的表達(dá)上調(diào)。特別是GGP基因，表達(dá)量明顯上調(diào)。相反的，在 SlGGP反義植株中，SlGGP-LIKE表達(dá)量上調(diào)不如GGP基因明顯。因此我們推測在 L-半乳糖途徑中，兩個基因相比較，GGP的表達(dá)更為重要。
　　（7）低溫

8、脅迫下，反義 SlGGP-LIKE番茄生長受到抑制的程度更為嚴(yán)重，PSII最大光化學(xué)效率、凈光合速率、P700的氧化狀態(tài)和D1蛋白含量與WT植株相比下降的更為明顯。并且反義植株積累了更多的活性氧，膜脂傷害程度更為嚴(yán)重，葉黃素循環(huán)的脫環(huán)氧程度更低。
　?。?）用丁香假單胞病原菌侵染轉(zhuǎn)基因反義番茄和WT植株后，病原菌對轉(zhuǎn)基因植株的傷害程度明顯小于WT植株。通過臺盼藍(lán)染色以及菌落數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果，均說明轉(zhuǎn)基因番茄對病原菌的抗性強(qiáng)于WT植株。

9、病原菌侵染后，轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)明顯的H2O2的快速累積的現(xiàn)象。通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，抗病基因PR1和NPR1基因在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)量明顯高于WT植株，同時轉(zhuǎn)基因番茄株系中水楊酸合成途徑關(guān)鍵基因ICS的表達(dá)量明顯高于WT植株。這說明SlGGP-LIKE參與了抗病響應(yīng)，并且是通過H2O2作為信號物質(zhì)誘導(dǎo)的水楊酸合成途徑增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因番茄的病原菌抗性。
　?。?）過表達(dá) SlGGP-LIKE明顯提高了轉(zhuǎn)基因煙草 AsA含量，減少了轉(zhuǎn)基