舒脈膠囊對缺血心肌大鼠促血管新生及改善左室重構(gòu)作用的實驗研究.pdf

1、第一部分舒脈膠囊對心肌缺血大鼠促血管新生的研究 背景： 本研究通過對心肌缺血大鼠缺血心肌組織學(xué)、形態(tài)學(xué)改變的觀察，通過超聲心動圖分析左室心功能，通過實時定量RT-PCR技術(shù)檢測缺血心肌VEGF、PDGF-BB mRNA的表達，以及通過Western blot檢測缺血心肌磷酸化PI3K/Akt、VEGF、PDGF-BB的蛋白表達的改變，通過免疫組化檢測缺血心肌微血管密度，探討舒脈膠囊在缺血心肌中促血管新生的作用，并探討其信

2、號調(diào)控機制，為其臨床防治缺血性心血管疾病提供更為可靠的科學(xué)依據(jù)。 目的： 1.通過觀察舒脈膠囊對實驗性大鼠缺血心肌組織學(xué)、形態(tài)學(xué)及心功能改變，及對毛細血管與微動脈的新生的影響，探討舒脈膠囊促血管新生的療效。 2.觀察舒脈膠囊對大鼠缺血心肌磷酸化PI3K、Akt蛋白表達，及VEGF、PDGF-BB的蛋白及mRNA表達影響，探討舒脈膠囊促進穩(wěn)定而有功能的血管新生的信號調(diào)控機制。 方法： 1.研究對象

3、 建立大鼠心肌缺血實驗?zāi)Ｐ蚖istar大鼠結(jié)扎左冠狀動脈前降支建立心肌缺血模型。造模成功的大鼠隨機分為舒脈大劑量/LY294002組、舒脈小劑量組、舒脈大劑量組、貝復(fù)濟組、模型組；另設(shè)假手術(shù)組。 2.研究內(nèi)容 （1）心功能檢測；（2）Western blot檢測缺血心肌VEGF、PDGF-BB、PI3K、p-Akt蛋白表達；（3）實時定量RT-PCR檢測缺血心肌VEGF、PDGF-BB mRNA表達；（4）檢測缺血

4、心肌微血管密度；（5）Masson染色檢測缺血心肌膠原含量的變化。 結(jié)果： 1.心功能檢測 治療第2周后，SMCH、SMCL、bFGF組的左室射血分數(shù)較MIR組顯著增高； SMCH與SMCL、bFGF組比較差異無顯著性意義。SMCH、SMCL、bFGF組左心室收縮末期內(nèi)徑、左心室舒張末期內(nèi)徑較MIR組顯著降低。 2.Western blot檢測分析 治療第2周后， SMCH、SMCL、bFGF組V

5、EGF、PDGF-BB、PI3K、p-Akt蛋白表達較MIR組顯著升高。 3.實時定量RT-PCR檢測 治療第2周后， SMCH組、SMCL組、bFGF組VEGF、PDGF-BB mRNA表達較MIR組顯著升高。SMCH/LY組VEGF、PDGF-BB mRNA表達與MIR組差異無顯著性意義。 4.缺血心肌微血管密度的測定 治療2周后，SMCH組、SMCL組、bFGF組的毛細血管密度均較MIR組明顯增高。

6、 5.Masson染色檢測缺血心肌膠原含量的變化 光鏡下Masson染色顯示，心肌細胞染色呈黃色，間質(zhì)膠原呈藍綠色。 結(jié)論： 1.本研究首次證明舒脈膠囊對心肌缺血大鼠具有顯著的促血管新生療效，改善MI大鼠心功能。表現(xiàn)為微血管密度的增加，心功能指標LVEF的提高，LVESD、LVEDD降低。且舒脈膠囊的療效具有劑量依賴性。 2.與MIR組比較，舒脈膠囊單獨治療顯著提高了缺血心肌VEGF、PDGF-B

7、B的表達水平，及磷酸化PI3K、Akt蛋白的表達水平。 3.與舒脈膠囊單獨治療比較，PI3K抑制劑和舒脈膠囊聯(lián)合治療顯著抑制PI3K/Akt信號通路的活性，同時明顯抑制舒脈膠囊促VEGF、PDGF-BB的高表達，及降低舒脈膠囊促毛細血管與微動脈新生的作用。證實舒脈膠囊促血管新生的分子機制是通過激活PI3K/Akt信號通路介導(dǎo)VEGF、PDGF-BB的表達、促進VEGF、PDGF-BB介導(dǎo)的毛細血管以及穩(wěn)定的側(cè)支循環(huán)的建立。

8、 第二部分舒脈膠囊改善心肌缺血大鼠左室重構(gòu)的研究 目的： 1.通過觀察舒脈膠囊對實驗性大鼠缺血心肌組織學(xué)、形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的改變、整體與局部心功能、α-SMA蛋白表達、及collagenⅠmRNA與蛋白表達的影響，探討舒脈膠囊減少心肌成纖維細胞增殖、降低心肌纖維化、及改善左室重構(gòu)的療效。 2.觀察舒脈膠囊對實驗性大鼠缺血心肌磷酸化應(yīng)激激活細胞絲裂原活化蛋白激酶、TNF-α、金屬蛋白酶組織抑制因子-1蛋白表達的影

9、響，探討舒脈膠囊改善左室重構(gòu)的機制。 方法： 1.研究對象 建立大鼠心肌梗死實驗?zāi)Ｐ蚖istar大鼠結(jié)扎左冠狀動脈前降支建立心肌缺血模型。造模方法同第一部分。造模成功的大鼠隨機分為舒脈大劑量組、舒脈小劑量組、p38MAPK抑制劑SB203580、模型組；另設(shè)假手術(shù)組。 2.研究內(nèi)容 （1）超聲心動檢測；（2）放射免疫法檢測血漿TNF-α含量；（3）Western blot檢測缺血心肌磷酸化p38

10、MAPK、TNF-α、TIMP-1蛋白表達；（4）實時定量RT-PCR檢測缺血心肌collagenⅠ mRNA表達；（5）免疫組化染色檢測缺血心肌collagenⅠ、α-SMA蛋白表達；（6）HE染色；（7）天狼猩紅染色檢測膠原含量的變化；（8）透射電鏡觀測心肌超微結(jié)構(gòu)變化。 結(jié)果： 1.左心室整體與局部功能超聲心動圖分析 在治療后第1、6周時進行了超聲檢查。左室射血分數(shù)是目前臨床上評價左心室整體功能最常用的指標

11、。治療第1周后，SMCH組、SMCL組、SB組的LVEF、BW較MIR組顯著增高，而LVESD、LVEDD、LVW/BW較MIR組顯著降低。局部室壁增厚率可用來反應(yīng)心肌局部功能。治療第1周后，SMCH組、SMCL組、SB組的WT較MIR組顯著增高。 2.血漿TNF-α水平的測定 通過放免法檢測SMC的抗炎癥的作用。治療1周后，MIR組、SMCH組、SMCL組血漿TNF-α水平較Sham組明顯升高。但是，SMCH組、SMC

12、L組、SB組血漿TNF-α水平較MIR組明顯降低。 3.Western blot檢測分析 治療1周后，MIR組大鼠心肌組織p-p38MAPK、TNF-α、TIMP-1蛋白的表達較Sham組明顯增加。SMCH、SMCL、SB組心肌組織p-p38MAPK、TNF-α、TIMP-1蛋白表達較MIR組明顯減少。進一步兩兩比較分析，SMCH組較SMCL組或SB組心肌組織p-p38MAPK、TNF-α、TIMP-1蛋白表達差異無顯著

13、性意義。 4.實時定量RT-PCR 通過實時定量RT-PCR檢測大鼠心肌組織collagenⅠmRNA的表達。治療1周后，MIR組大鼠心肌組織collagenⅠmRNA的表達較Sham組明顯增加。SMCH、SMCL、SB組心肌組織collagenⅠ mRNA表達較MIR組明顯減少。進一步兩兩比較分析，SMCH組較SMCL組或SB組心肌組織collagenⅠ mRNA表達差異無顯著性意義。 5.免疫組化染色分析

14、 5.1α-SMA表達 α-平滑肌激動蛋白是檢測CFs增殖的可靠指標。通過免疫組化染色法可使陽性指標呈棕色或棕黃色染色。α-SMA主要表達于VSMC與CFs中。 5.2 CollagenⅠ表達 治療1周后，通過免疫組化檢測到MIR組心肌間質(zhì)中較Sham組明顯增多的棕褐色陽性表達。SMCH、SMCL、SB治療組的Ⅰ型膠原的陽性表達較MIR組顯著降低。進一步兩兩比較分析，SMCH組較SMCL組或SB組心肌間質(zhì)co

15、llagenⅠ的表達無顯著性差異。 6.HE染色 Sham組大鼠心肌細胞細長，細胞分界較清楚，胞核大小均一，染色正常。肌纖維排列緊密整齊，壁內(nèi)小動脈管壁及管腔正常，管周纖維組織少；MIR組大鼠心肌細胞減少，細胞核大小不甚規(guī)則，心肌細胞肥大，分界不清楚。肌纖維排列較紊亂，壁內(nèi)小動脈管壁厚，管腔狹小，管周纖維組織增多。CFs大量增殖、聚集。 7.天狼猩紅染色膠原含量的變化 6周時，各組大鼠心肌纖維化面積均有

16、不同程度的提高。MIR組大鼠心肌存在廣泛的心肌纖維化，且心肌纖維化面積明顯高于1周組。 8.透射電鏡觀測心肌超微結(jié)構(gòu)變化 Sham組大鼠心肌肌原纖維排列整齊、緊密，無斷裂，肌絲清晰，細胞核發(fā)育良好，線粒體體積大數(shù)量多，嵴豐富排列緊密呈Z字型，肌漿網(wǎng)體積大，數(shù)量多，胞漿豐富。 結(jié)論： 1.舒脈膠囊對MI大鼠左室重構(gòu)有明顯的逆轉(zhuǎn)作用，其具體表現(xiàn)為：改善MI大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)指標，降低心肌CFs增殖與ECM膠