過氧化氫誘導斜帶石斑魚肝細胞氧化損傷的轉錄組學研究.pdf

1、1.H2O2誘導斜帶石斑魚肝細胞氧化損傷模型的建立
　　通過不同的過氧化氫培養(yǎng)濃度(0、100、200、400、600、800、1000μmol/L)和作用時間(2、4、6、8、12、24h)探索適宜的斜帶石斑魚肝細胞氧化損傷濃度和時間，以建立的斜帶石斑魚原代肝細胞氧化損傷模型，并檢測培養(yǎng)過程中肝細胞的數(shù)量和活性的變化。采用單因子完全隨機設計實驗，根據(jù)臺盼藍對死細胞拒染法利用血球計數(shù)板測定細胞活力及數(shù)量，并通過MTT法測定細胞存活

2、率。結果顯示，800μmol/L H2O2，作用8h，斜帶石斑魚肝細胞的存活率降低至61.98％。
　　2.H2O2對斜帶石斑魚原代肝細胞活性及功能的影響
　　本研究采用斜帶石斑魚原代肝細胞模型，主要探究過氧化氫對原代培養(yǎng)的肝細胞氧化損傷機制的影響。通過測定不同培養(yǎng)時間下過氧化氫不同作用濃度的肝細胞或培養(yǎng)上清液中的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、脂質過氧化物(LPO)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、過氧化氫

3、酶(CAT)的變化，分析細胞生長代謝狀態(tài)。結果顯示，使用過氧化氫處理后其他各組與800μmol/L和1000μmol/L組相比顯著降低了CAT、GSH-PX和SOD活性，顯著升高LPO、MDA含量(P＜0.05），但是800和1000μmol/L組之間沒有顯著差異(P＞0.05)。結果發(fā)現(xiàn):H2O2過氧化氫作用時間為8h、作用濃度為800μmol/L，使斜帶石斑魚原代肝細胞產(chǎn)生了明顯的氧化應激，該條件可作為建立斜帶石斑魚肝細胞氧化損傷模

4、型的適宜條件。
　　3.利用轉錄組學技術研究過氧化氫對肝細胞差異表達影響
　　本研究以過氧化氫為刺激源誘導建立了斜帶石斑魚肝細胞氧化損傷模型，試驗基于RNA-Seq技術對正常處理組(L-15)和對照組(800μmol/L H2O2)的斜帶石斑魚肝細胞進行測序，利用轉錄組學技術深度分析細胞內(nèi)部基因的轉錄調(diào)控以及過氧化氫處理后細胞表型和功能的改變。結果顯示，通過轉錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，對83，802，103條原始reads的篩選和排

5、除，拼接獲得到了112，618條Unigenes，平均長度為957.45bp，N50為1，687bp。按照Blast等相關軟件，對數(shù)據(jù)進行相關分析后，共得到功能注釋基因110，560個。依據(jù)GO富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達基因主要被集中在代謝通路、細胞過程、生物調(diào)控等通路中，在KEGGpathway富集分析中結果顯示，代謝通路涉及基因最多，有170個。兩種水平下（過氧化氫處理組和對照組）共差異表達的基因共2，570個，其中上調(diào)的基因1，520