過(guò)氧化氫誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡后miRNA變化的研究.pdf

1、顱腦損傷是法醫(yī)實(shí)際工作中最重要的損傷和最常見(jiàn)的死因之一，也是國(guó)內(nèi)外法醫(yī)病理學(xué)研究的熱點(diǎn)。在顱腦損傷及腦卒中所致的腦缺血再灌注過(guò)程中，腦缺血缺氧引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)所產(chǎn)生的大量氧自由基是引起腦損傷的主要原因之一。近年研究發(fā)現(xiàn)，自由基損傷所造成的細(xì)胞凋亡是組織缺血引起損傷的重要環(huán)節(jié)。H<,2>O<,2>是非自由基，但也是一種氧化作用很強(qiáng)的活性氧，是機(jī)體自由基產(chǎn)生的重要環(huán)節(jié)。PC12細(xì)胞是從可移植的大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤克隆而來(lái)，具有交感神經(jīng)元的生理、

2、生化特征且該細(xì)胞株具有相當(dāng)高的穩(wěn)定性和同質(zhì)性，分化程度高，是目前廣泛用來(lái)研究神經(jīng)細(xì)胞功能、分化發(fā)育和死亡的一種組織細(xì)胞培養(yǎng)模型。本實(shí)驗(yàn)中以過(guò)氧化氫(H<,2>O<,2>)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷，作為神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的模型。 微小RNA(microRNA)是一種長(zhǎng)度約為18～25nt的非編碼RNA，這些miRNA可以通過(guò)與特定mRNA結(jié)合或調(diào)節(jié)特定mRNA的蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程來(lái)調(diào)控基因表達(dá)，目前人類基因組中已確認(rèn)的有幾百個(gè)，可能參與

3、30﹪人類蛋白質(zhì)的表達(dá)調(diào)控，從而在機(jī)體的發(fā)育、神經(jīng)分化、細(xì)胞增殖、凋亡和脂肪代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。近年來(lái)隨著新的miRNA的不斷發(fā)現(xiàn)及許多miRNA功能的不斷發(fā)現(xiàn)，miRNA的研究倍受關(guān)注，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)PC12細(xì)胸凋亡后miRNA的變化，有望為腦缺血再灌注損傷的機(jī)制和治療的研究提供理論依據(jù)和新的研究思路。 1.目的:用miRNA基因芯片技術(shù)檢測(cè)H<,2>O<,2>誘導(dǎo)凋亡的PC12細(xì)胞和正常PC12細(xì)胞,

4、miRNA的表達(dá)譜差異，為腦缺血再灌注損傷中神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制和治療的研究提供理論依據(jù)和新的研究思路。 2.方法: 2.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理以0濃度組作為對(duì)照，分別用30nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L和400nmol/L的H<,2>O<,2>處理PC12細(xì)胞12h； 2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)活力往已處理好的96孔培養(yǎng)板每孔加入5g/LMTT20μL，37℃孵育4 h，吸出培

5、養(yǎng)基，每孔加100μLDMSO溶解結(jié)晶，微型振蕩器上振蕩10min，用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm處的吸光度值(A值)。細(xì)胞存活率按公式計(jì)算：細(xì)胞存活率=處理組A490/對(duì)照組A490×100﹪。 2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC12細(xì)胞的凋亡率收集已處理好的6孔板各孔細(xì)胞，按Annexin V-FITC/PIDetectionKit操作說(shuō)明處理細(xì)胞，在FITC-MF20流式細(xì)胞儀上測(cè)細(xì)胞Annexin V-FITC/PI熒光值。 2.

6、4 microRNA的基因芯片研究分別提取A(0濃度H<,2>O<,2>處理組)和B(400nmol/LH<,2>O<,2>處理組)PC12細(xì)胞的總RNA和miRNA；對(duì)上述提取的miRNA做miRNA芯片檢測(cè)并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。 3.結(jié)果: 3.1 H<,2>O<,2>對(duì)PC12細(xì)胞生長(zhǎng)活力的影響隨著處理濃度的增加，PC12細(xì)胞的生長(zhǎng)活力逐漸降低，與0濃度處理組相比，30nmol/L、50nmol/L、100nmol

7、/L、200nmol/L和400nmol/L的H<,2>O<,2>處理的PC12細(xì)胞生存率分別為92±9.80﹪、90±14.70﹪、80±13.85﹪、54±12.33﹪、22±7.35﹪(P<0.01)； 3.2流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率 0、30nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L和400nmol/L，的H<,2>O<,2>處理的PC12細(xì)胞早期凋亡率分別為2.6﹪、5.2﹪、7.2﹪、10

8、.4﹪、16.6﹪、72.2﹪： 3.3 microRNA的基因芯片研究結(jié)果在樣品A中共篩選出68個(gè)有效表達(dá)的microRNA分子數(shù)據(jù)，在樣品B中篩選出46個(gè)有效表達(dá)的microRNA分子數(shù)據(jù)，兩者樣品中均檢測(cè)到有效表達(dá)的microRNA分子有39個(gè)，其中與樣品A相比，在樣品B中顯著性下調(diào)表達(dá)的有6個(gè)。 4.結(jié)論: 4.1 以不同濃度的過(guò)氧化氫(H<,2>O<,2>)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷，成功模擬了不同程度的腦缺