NF-κB抑制劑對急性肺損傷大鼠趨化因子基因表達和中性粒細胞凋亡的影響.pdf

1、目的：急性肺損傷(Acutelunginjury，ALI)是由多種損傷原因造成的肺損害。研究資料表明，在ALI形成的病理過程中中性粒細胞(polymorphonuclearneutrophil，PMN)發(fā)揮著重要作用。大量研究顯示，當(dāng)機體遭受如創(chuàng)傷、感染等嚴重外界打擊時，PMN會迅速進入肺實質(zhì)大量聚集、扣押并持續(xù)活化，這在其后發(fā)生的急性肺損傷中發(fā)揮著重要作用。目前，有關(guān)ALI時PMN為何會大量向肺組織遷移、聚集以及進入肺組織內(nèi)的PMN如

2、何演變，這些變化又對急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展有何影響等問題的研究還尚少。本實驗主要通過腹腔注射脂多糖(lipopolysacchride，LPS)復(fù)制大鼠ALI模型，研究ALI時大鼠肺內(nèi)中性粒細胞趨化因子(cytokine-inducedneutrophilchemoattractant，CINC)基因的表達和PMN凋亡率的變化，探討兩者對PMN的影響及它們在ALI發(fā)病中的作用機制，后進一步從細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB角度研究其對CINC表達

3、和PMN凋亡的調(diào)節(jié)機制，并給予抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(Ammoniumpyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)進行干預(yù)，從而為臨床治療ALI提供理論依據(jù)，也為開拓新的ALI治療思路提供參考。 方法：1動物模型的建立及分組：健康雌性Wistar大鼠120只，體重230-250克，購自河北省實驗動物中心。采用腹腔注射脂多糖(LPS)方法復(fù)制動物急性肺損傷模型。動物分組：120只大鼠隨機分為4組：①正常對

4、照組(C組=12只)：腹腔注射生理鹽水3ml/Kg；②PDTC對照組(P組=12只)：先腹腔注射PDTC120mg/Kg，半小時后再腹腔注射生理鹽水3ml/Kg；③急性肺損傷組(L組=48只)：大鼠腹腔注射LPS3mg/Kg；④急性肺損傷+PDTC干預(yù)組(P+L組=48只)：先腹腔注射PDTC120mg/Kg進行干預(yù)，半小時后再腹腔注射LPS3mg/Kg。后兩組又分別以腹腔注射LPS后的2h、4h、8h和12h作觀測點，處死動物、取材，

5、每個觀測時間點組12只大鼠。 2標本的制備：因所測全部指標無法一次留取成功，故先隨機從4個實驗組中各取6只大鼠行第一部分取材：制模后，于各不同觀測時間點腹腔注射10％水合氯醛3.5ml/Kg麻醉，固定動物、開胸、心臟放血處死大鼠后，速取左肺葉置液氮中速凍，-80℃冰箱保存，待測。另取右肺上、下兩葉，上葉稱濕重，放入烤箱；下葉置4％多聚甲醛固定，待測。再取各實驗組剩余的6只大鼠行第二次取材：同法制模、麻醉、處死動物，氣管插管，結(jié)扎

6、右肺支氣管，取右肺下葉置4％多聚甲醛內(nèi)固定，待做病理切片；行左肺支氣管肺泡灌洗，收集全部灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid，BALF)分離PMN。3指標的測定：光鏡觀察肺組織病理變化判定制模成功后，稱重檢測肺組織濕/干重比值(W/D)、RT-PCR法檢測肺組織CINCmRNA表達、免疫組化法檢測NF-κBp65蛋白表達、流式細胞儀檢測BALF中PMN凋亡率。 4統(tǒng)計學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差((-

7、x)±s)表示，采用SAS6.12統(tǒng)計軟件分析。采用方差分析、Q檢驗和直線相關(guān)進行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果：1肺組織病理結(jié)果：C組、P組，肺組織結(jié)構(gòu)完整，無炎癥細胞滲出；L組，肺間隔增厚，肺泡壁斷裂，大量PMN等炎癥細胞浸潤，且隨時間的延長炎性細胞浸潤增多，肺組織損傷程度加重。P+L組，肺組織有同L組相似的病理表現(xiàn)，但對應(yīng)相應(yīng)時間點，肺組織損傷程度較輕。 2肺組織濕/干重(W/D)比值：C組[4.28

8、±0.055]與P組[4.32±0.055]比兩者差異無意義(P＞0.05)；L組，各時間點W/D比值[2h組4.71±0.081、4h組4.94±0.082、8h組5.45±0.084、12h組5.80±0.085]均較對照組C組高，且隨注射LPS后時間的延長W/D比值不斷增高，L12h組比值達高峰(P＜0.05)；P+L干預(yù)組，各時間點W/D比值[2h組4.43±0.058、4h組4.52±0.057、8h組4.96±0.058、1

9、2h組5.31±0.058]均較相應(yīng)時間點L各組數(shù)值減低(P＜0.05)，但與對照組P組比，各組數(shù)值仍較高(P＜0.05)。 3肺組織CINCmRNA表達：C組[0.02±0.016]與P組[0.03±0.013]比兩者差異無意義(P＞0.05)；L組，各時間點CINCmRNA[2h組0.65±0.056、4h組0.34±0.029、8h組0.19±0.024、12h組0.10±0.014]均較對照組C組高(P＜0.05)，其中

10、L2h組CINCmRNA達高峰(P＜0.05)，之后表達逐漸減低；P+L干預(yù)組，各時間點CINCmRNA[2h組0.46±0.040、4h組0.27±0.041、8h組0.15±0.030、12h組0.06±0.025]與相應(yīng)時間點L各組比，表達下降(P＜0.05)，但與對照組P組比，CINCmRNA仍高(P＜0.05)。 4肺組織NF-κBp65表達：光鏡下肺組織細胞內(nèi)有棕黃色顆粒的為NF-κBp65呈陽性表達的細胞。記數(shù)陽性

11、細胞數(shù)，C組[(166.17±13.83)個]與P組[(163.83±5.56)個]比兩者差異無意義(P＞0.05)；L組，各時間點陽性細胞數(shù)[2h組(608.17±27.04)個、4h組(376.50±14.10)個、8h組(231.33±18.61)個、12h組(210.67±12.29)個]均較對照組C組多(P＜0.05)，其中L2h組陽性細胞最多(P＜0.05)，且光鏡示棕黃色顆粒大多表達在細胞核內(nèi)，此時NF-κB呈活化狀態(tài)，之

12、后陽性表達逐漸減少；P+L干預(yù)組，各時間點陽性細胞數(shù)[2h組(366.50±15.23)個、4h組(268.83±25.02)個、8h組(196.50±12.69)個、12h組(186.83±8.35)個]與相應(yīng)時間點L各組比較，陽性細胞減少(P＜0.05)，但與對照組P組比，表達仍較多(P＜0.05)。 5BALF中PMN凋亡率：用流式細胞儀測定BALF中PMN的凋亡率，C組[(13.12±1.73)％]與P組[(13.35±

13、1.62)％]比兩者差異無意義(P＞0.05)；L組，各時間點PMN的凋亡率[2h組(6.98±0.71)％、4h組(3.52±0.34)％、8h組(4.51±0.31)％、12h組(5.02±0.11)％]均較對照組C組低(P＜0.05)，其中L4h組PMN的凋亡率最低，此時細胞壽命最長(P＜0.05)，之后凋亡率逐漸增加；P+L干預(yù)組，各時間點PMN的凋亡率[2h組(8.70±0.43)％、4h組(5.74±0.17)％、8h組(6

14、.92±0.07)％、12h組(7.49±0.12)％]與相應(yīng)時間點L各組比凋亡率均增加(P＜0.05)，但與對照組P組比，PMN的凋亡率仍較低(P＜0.05)。 6相關(guān)分析：NF-κBp65與CINCmRNA和PMN凋亡率之間均具有相關(guān)性，前兩者呈顯著正相關(guān)r=0.9643，P＜0.001；后兩者呈負相關(guān)r=-0.3022，P＜0.05。另外，CINCmRNA與PMN凋亡率兩者之間也有相關(guān)關(guān)系，呈負相關(guān)r=-0.3286，P＜

15、0.05。 結(jié)論：1大鼠急性肺損傷時存在肺組織CINCmRNA高表達、PMN向肺組織大量浸潤和BALF中PMN凋亡延遲的現(xiàn)象，表明ALI的發(fā)生可能與CINC誘導(dǎo)、趨化PMN由外周血向肺組織內(nèi)遷移以及進入肺內(nèi)的PMN發(fā)生凋亡延遲、壽命延長、持續(xù)發(fā)揮炎性反應(yīng)等變化有關(guān)。 2CINCmRNA和PMN凋亡受多種因子影響。急性肺損傷時大鼠肺組織NF-κB激活，NF-κBp65表達增多，其增高與肺組織CINCmRNA高表達和BALF

16、中PMN凋亡延遲都具有相關(guān)關(guān)系，表明CINCmRNA和PMN的凋亡受轉(zhuǎn)錄因子NF-κB調(diào)節(jié)。另外，CINCmRNA和PMN凋亡之間也有相關(guān)性，CINCmRNA的高表達可抑制PMN凋亡的比例，表明急性肺損傷是由多種炎癥介質(zhì)共同參加、相互影響的級連式反應(yīng)過程。 3PDTC作為NF-kappaB的抑制劑可通過抑制NF-κB的活化、入核，從起始階段就降低了CINCmRNA的高表達并使PMN保持正常的凋亡比例，減少了引起肺組織損傷的PMN