畢赤酵母表達(dá)皮蠅素C蛋白及牛皮蠅蛆病診斷技術(shù)的研究.pdf

1、皮蠅素 C (Hypodermjn C,Hc)是皮蠅第一期幼蟲在宿主體內(nèi)移行過程中分泌的一種絲氨酸蛋白酶,對(duì)皮蠅有很高的抗原性和特異性,是一種理想的檢測(cè)抗原. 本文首次建立了用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組HC蛋白的技術(shù),對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了生物特性的鑒定,對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化研究.將經(jīng)PCR擴(kuò)增出的HC基因連接到畢赤酵母一大腸桿菌穿梭質(zhì)粒pPIC9k上,構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pPIC9k-HC,測(cè)序鑒定插入序列.重組質(zhì)粒線性化后,通過電激轉(zhuǎn)化

2、入酵母細(xì)胞GS115中,用組氨酸缺陷培養(yǎng)基篩選含重組質(zhì)粒的克隆,用含1.0mg/mlG418的YPD培養(yǎng)基篩選含多拷貝質(zhì)粒的克隆.重組酵母細(xì)胞在含甲醇的培養(yǎng)基中分泌產(chǎn)生目的蛋白,培養(yǎng)60小時(shí)后收取上清,用陰離子交換層析柱分離純化.經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)表達(dá)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量約為28 KD,表達(dá)上清經(jīng)超濾濃縮和陰離子交換層析初步純化,所得純化產(chǎn)物經(jīng)Western-blot表明具有與兔抗HC血清特異性結(jié)合的能力;明膠電泳檢測(cè)顯示具有水解

3、酶活性.單因素改變表達(dá)條件的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)甲醇濃度為1.0﹪,甘油濃度為0.25﹪,pH值為6.0,誘導(dǎo)60h的情況下表達(dá)產(chǎn)量最高,表達(dá)量約為121 mg/L,顯著高于其他表達(dá)方法. 用表達(dá)純化的蛋白作為檢測(cè)抗原,進(jìn)行了牛皮蠅蛆病ELISA診斷方法的研究:通過對(duì)ELISA反應(yīng)條件的系列摸索,確定了各組分的最適工作條件:抗原的最適濃度為1 μ g/ml,最佳封閉條件是5﹪脫脂乳37℃封閉3h,血清的稀釋度為1∶50,作用時(shí)間