畢赤酵母表達甘露糖化人溶菌酶研究.pdf

1、胞內(nèi)菌的治療是目前臨床醫(yī)療的難題之一。如結核分枝桿菌、沙門傷寒菌、嗜肺軍團菌等胞內(nèi)菌，它們通常寄生在人體吞噬細胞內(nèi)，往往會對人體造成慢性持續(xù)性感染。當這些病菌侵染人體后會被吞噬細胞吞噬，但吞噬細胞不能像裂解大腸桿菌等非胞內(nèi)菌那樣將其殺死。例如胞內(nèi)菌中的結核分枝桿菌已演化出了逃逸吞噬細胞裂解的機制，它通過阻止其所在吞噬泡的酸化進程，來阻止吞噬泡與溶酶體的融合。這樣結核分枝桿菌就能長期寄生在胞內(nèi)，并在人體免疫能力下降時侵染周圍細胞。胞內(nèi)菌的

2、治療主要是用抗生素等抗菌藥長期療法，大多數(shù)的抗生素等抗菌藥治療胞外菌療效好，但它們很難進入細胞內(nèi)或入胞濃度低難以殺死胞內(nèi)寄生菌，并且長期用藥也容易產(chǎn)生耐藥菌。為探索解決胞內(nèi)菌的治療難題，本研究利用畢赤酵母表達甘露糖化人溶菌酶，并利用該酶具有的甘露糖殘基是巨噬細胞表面甘露糖受體的配體這一特點，研究利用巨噬細胞受體與配體之間的相互作用介導甘露糖化人溶菌酶內(nèi)吞，以達到殺死寄生在巨噬細胞內(nèi)病菌的目的。
　　 巨噬細胞等吞噬細胞是人體的固

3、有免疫細胞，它們構成人體的第二道防線。巨噬細胞能通過細胞表面受體來識別入侵機體的病原體，在眾多的表面受體中，甘露糖受體是重要的病原體模式識別受體之一。巨噬細胞能通過甘露糖受體的介導作用，將帶有甘露糖糖鏈修飾的病原體內(nèi)吞到胞內(nèi)。因此利用甘露糖殘基修飾的藥物靶向巨噬細胞是一條值得探索的藥物遞送途徑。巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)是成功的蛋白分泌表達系統(tǒng)之一，該系統(tǒng)能對蛋白進行多種翻譯后加工修飾，如能特異性在NXS/T(X為除脯氨酸以外的所有氨基酸)

4、位點的天冬酰胺上進行外側鏈為甘露糖殘基的糖基化修飾。利用畢赤酵母的這一特性，可以使具有N-糖基化位點的蛋白進行甘露糖化修飾。人溶菌酶具有水解細菌肽聚糖層中N-乙酰胞壁酸與N-乙酰葡糖胺之間的β-1.4糖苷鍵能力，它能殺死革蘭氏陽性菌，在體內(nèi)的補體的幫助下對革蘭氏陰性菌也有一定的抑殺作用，因此具有潛在的藥用價值。但是天然的人溶菌酶沒有N-糖基化位點，理論上用畢赤酵母表達該蛋白也不會產(chǎn)生N-糖基化修飾。為獲得甘露糖化修飾的人溶菌酶及對其相關

5、特性的研究，本實驗從以下幾個方面進行：
　　 1、利用畢赤酵母表達甘露糖化修飾的人溶菌酶突變體本研究得到C-端融合2個N-糖基化位點序列的人溶菌酶突變體的融合基因，并以此構建了pPICZαA-hLYZ-myc-His載體，將該載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株。得到重組菌分泌表達的蛋白通過SDS-PAGE分析顯示為一彌散的條帶，彌散蛋白相對分子質(zhì)量(Mr)位于20-45kDa之間。取其中Mr最小的帶做肽指紋圖譜分析，結果該重組蛋白的

6、氨基酸序列與人源溶菌酶lysozymeprecursor(EC3.2.1.17)的氨基酸重合率達36％；Western印跡表明彌散的重組蛋白均能與鼠抗人溶菌酶單克隆抗體特異性結合；重組蛋白經(jīng)過PNGaseF酶切分析，SDS-PAGE顯示彌散條帶消失，在理論Mr附近出現(xiàn)一條分子量均一的條帶；用伴刀豆蛋白A(ConA)對該重組蛋白進行檢測，結果表明該重組蛋白可以與ConA特異性結合。以上結果表明得到的重組蛋白為甘露糖化修飾的人溶菌酶。

7、>　　 2、甘露糖化修飾的人溶菌酶可以被巨噬細胞內(nèi)化通過構建人溶菌酶與增強型綠色熒光蛋白融合蛋白的融合基因載體pPICZαA-hLYZ/eGFP，電轉(zhuǎn)GS115構建重組菌GS115/pPICZαA-hLYZ/eGFP，該重組菌誘導表達重組融合蛋白，通過硫酸銨沉淀、G25柱脫鹽、鎳親和層析純化獲得目的重組融合蛋白，脫去咪唑與鹽后凍干濃縮，將該重組融合蛋白與Raw264.7細胞共孵育，用激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)有綠色熒光物質(zhì)進入Raw2

8、64.7，而在有甘露糖競爭性配體甘露聚糖存在時，觀察不到有綠色熒光物質(zhì)進入Raw264.7細胞。此現(xiàn)象說明甘露糖化人溶菌酶能進入巨噬細胞且這一過程是由甘露糖受體介導的。
　　 3、低甘露糖化糖基酵母工程菌GJK05表達人溶菌酶及其活性鑒定通過構建pPICZαA-hLYZ載體及用作對照的載體pPICZαA-hLYZ(N/Q)，電轉(zhuǎn)化低糖基化酵母工程菌及GS115菌株，分別構建重組菌表達重組蛋白hLYZ及hLYZ(N/Q)。用伴刀豆

9、蛋白A(ConA)檢測重組蛋白的甘露糖化修飾；平板抑菌圈法比較重組人溶菌酶的活性，發(fā)現(xiàn)GS115表達高甘露糖化的重組人溶菌酶影響了其抑菌的活性。低糖基化酵母工程菌GJK05表達的重組人溶菌酶與Raw264.7進行免疫熒光實驗，激光共聚焦顯微鏡可觀察到Raw264.7細胞內(nèi)有熒光物質(zhì)。
　　 綜上述：本研究獲得了具有活性的甘露糖化的重組人溶菌酶，該重組蛋白具有體外抑菌活性，并且能夠在巨噬細胞表面的甘露糖受體的介導下進入巨噬細胞，為