一種新型人溶菌酶同源蛋白LYC1在畢赤酵母中的重組表達與發(fā)酵研究.pdf

1、溶菌酶在自然界有廣泛的分布，全稱1,4-β-N-乙酰胞壁酸聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrolase)，簡稱胞壁酸酶或胞壁質(zhì)酶（muramidase）。溶菌酶作為一種先天非特異免疫防御因子，在機體對抗感染性病原菌中發(fā)揮重要作用。根據(jù)其物種來源以及結(jié)構(gòu)、分子量的不同可分為以下六種類型:雞型溶菌酶(chicken type，c型);鵝型溶菌酶(geese type，g型);無脊椎動物溶菌酶(inverte

2、brate type，i型);植物溶菌酶;微生物溶菌酶;噬菌體溶菌酶(phage type，p型)。C型溶菌酶是分布最廣泛也是唯一同時在脊椎動物和無脊椎動物中存在的類型，因此人們對c型溶菌酶的研究也最為深入。
　　LYC1(LYZL6)是本實驗室發(fā)現(xiàn)和克隆的一個新的人c型溶菌酶家族基因。對LYC1蛋白序列的分析表明，它與人溶菌酶氨基酸序列上的一致性達到44％，并具有c型溶菌酶保守的8個Cys殘基以及Glu-35和Asp-52催化殘

3、基。
　　本研究通過建立和應(yīng)用畢赤酵母表達系統(tǒng)，依據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好特性人工合成了去除自身信號肽的LYC1基因序列，并構(gòu)建畢赤酵母α-因子信號肽引導(dǎo)表達具有天然N端LYC1的重組pPIC9k-LYC1分泌型畢赤酵母載體。將線性化重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入畢赤酵母菌株GS115和SMD1168中，使其定點整合進畢赤酵母基因組中。通過營養(yǎng)篩選以及多拷貝篩選，獲得穩(wěn)定整合表達載體的多拷貝插入菌株。通過搖瓶培養(yǎng)和誘導(dǎo)，篩選出表達能力強的重組菌株，

4、并優(yōu)化表達條件。進一步在30L發(fā)酵罐上進行發(fā)酵研究，通過控制發(fā)酵工藝如轉(zhuǎn)速、通氣量、甘油/甲醇流加方式、溫度、pH等參數(shù)以及添加補料，使蛋白表達量得到了提升，為接下來的純化工作提供了一定量的目標(biāo)蛋白。
　　SDS-PAGE顯示LYC1重組蛋白發(fā)酵上清呈現(xiàn)不均一性，可能是重組蛋白發(fā)生了降解、糖基化或聚集導(dǎo)致。對樣品的質(zhì)譜分析證實了LYC1的表達。GS115重組菌株蛋白表達量較SMD1168為少，這可能因為GS115表達蛋白降解更為嚴