2，4-二甲氧基反式芪(S3)抗實驗動物老年癡呆作用機(jī)制初步研究.pdf

1、木豆葉芪類提取物(sECC)的合成類似物2,4-二甲氧基反式芪(S3)為芪類化合物。本實驗室既往發(fā)現(xiàn)，sECC具有廣泛的藥理活性，如抗骨質(zhì)疏松作用及降血脂等活性。本文主要就S3抗實驗動物老年癡呆作用機(jī)制及其初步安全性進(jìn)行了探討。
　　 一.S3對體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用：
　　 1.采用H2O2損傷SH-SY5Y細(xì)胞，觀察S3對SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用。SH-SY5Y細(xì)胞給藥2h后，與H2O2(100μ

2、mol/L)共同孵育12h，采用MTT法和流式細(xì)胞儀法檢測細(xì)胞活力與細(xì)胞凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，S3能以濃度依賴方式提高細(xì)胞活力，分別提高19％，15％和8.3％(P<0.01)；同時發(fā)現(xiàn)，S3能降低細(xì)胞凋亡率。本實驗提示，S3能改善H2μ2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞活力的降低，減少H2μ2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。
　　 2.采用Aβ25-35損傷SH-SY5Y細(xì)胞，觀察S3對SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用。SH-SY5Y細(xì)

3、胞給藥10min后，與Aβ25-35(50μmol/L)共同孵育48h，采用MTT法、Hoechst3342、JC-1及DCFH-DA探針染色，分別檢測測細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度及細(xì)胞膜電位的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S3在10-6mol/L時提高細(xì)胞活力30.8％(P<0.01)；S3能以濃度依賴方式減少細(xì)胞內(nèi)ROS的量，分別減少51.0％，40.2％，25.0％(P<0.01)；同時，S3明顯減少Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和恢復(fù)

4、Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞膜電位降低。因此，S3可能通過其抗氧化活性，降低ROS的產(chǎn)生，恢復(fù)線粒體膜電位從而保護(hù)Aβ25-35對SH-SY5Y細(xì)胞的損傷作用，此作用可能與雌激素受體無關(guān)。
　　 二.S3對小鼠側(cè)腦室注射Aβ25-35誘導(dǎo)神經(jīng)損傷的保護(hù)作用：
　　 采用Aβ25-35側(cè)腦室注射誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)損傷，觀察S3對實驗動物AD模型小鼠神經(jīng)損傷保護(hù)作用。小鼠給藥1周后，側(cè)腦室注射Aβ25-35，通過Morris水迷宮和T

5、UNEL免疫組化方法檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，同時通過比色法檢測海馬和皮質(zhì)中AchE、ChAT、SOD酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S3能改善側(cè)腦室注射Aβ25-35導(dǎo)致的記憶損傷及海馬區(qū)的神經(jīng)元凋亡。此外，S3在50mg/kg/d能明顯提高皮質(zhì)和海馬區(qū)SOD和ChAT酶活性(P<0.05)，并降低AchE酶活性(P<0.05)。因此，S3可能是通過增加SOD活性，清除自由基，并上調(diào)ChAT、下調(diào)AchE活性從而提高中樞系統(tǒng)乙酰膽堿

6、水平，并減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到改善模型小鼠空間學(xué)習(xí)能力。
　　 三.S3對高脂+側(cè)腦室注射Aβ25-35誘導(dǎo)大鼠記憶缺陷的保護(hù)作用：
　　 采用高脂+Aβ25-35側(cè)腦室注射誘導(dǎo)神經(jīng)損傷，觀察S3對高脂+Aβ25-35側(cè)腦室注射大鼠神經(jīng)保護(hù)作用。大鼠經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)45d后，側(cè)腦室注射Aβ25-35同時給予S3和E2。通過Morris水迷宮和跳臺實驗評價大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，TUNNEL免疫組化方法檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡。此外

7、，通過比色法檢測海馬組織中SOD、GSH-PX、AchE、ChAT酶活性及MDA含量。同時，通過Elisa方法法和WB法檢測了海馬組織Ach水平和Cyto-C的釋放。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S3能改善高脂+側(cè)腦室注射Aβ25-35誘導(dǎo)神經(jīng)損傷大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。乙酰膽堿是參與學(xué)習(xí)記憶非常重要的神經(jīng)遞質(zhì)，我們發(fā)現(xiàn)S3能明顯升高海馬組織中乙酰膽堿含量(P<0.05)，同時發(fā)現(xiàn)S3上調(diào)ChAT(P<0.01)和下調(diào)AchE(P<0.05)的活性，因此，S3

8、可能通過上調(diào)ChAT和下調(diào)AchE的活性并升高海馬組織中乙酰膽堿含量，從而提高模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。此外發(fā)現(xiàn)，S3減少Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，同時發(fā)現(xiàn)S3能減少MDA的生成(P<0.05)、抑制cyto-c(P<0.01)釋放從而抑制凋亡信號，減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。此作用可能與S3能提高GSH-PX(P<0.05vs)和SOD(P<0.05)酶活性有關(guān)。因此，S3可能通過上調(diào)GSH-PX和SOD酶的活性，抑制脂質(zhì)過氧化，保護(hù)線粒

9、體膜，減少cyto-C釋放，抑制凋亡信號的產(chǎn)生，從而減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。同時，提高ChAT酶活，降低AchE酶活性，提高中樞Ach水平，從而改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。
　　 四.S3對去卵巢大鼠皮質(zhì)、海馬AQP1、AQP4表達(dá)的影響：
　　 采用去卵巢大鼠，觀察S3對去卵巢大鼠海馬和皮質(zhì)中QP1、AQP4的表達(dá)的影響。大鼠去卵巢4周，給藥12周，采用放免法檢測血清中激素水平，采用Elisa法檢測皮質(zhì)和海馬中QP1、AQP4

10、的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S3能上調(diào)去卵巢大鼠血清中雌激素水平(P<0.01)，下調(diào)血清中FSH、LH水平(P<0.05)，下調(diào)皮質(zhì)、海馬中AQP1、AQP4的表達(dá)(P<0.01)。表明S3可能參與去卵巢大鼠中樞系統(tǒng)的物質(zhì)轉(zhuǎn)運。
　　 五.S3初步安全性實驗：
　　 采用MTT方法，評價S3對MCF-7細(xì)胞增殖的影響，同時，大劑量S3灌胃，觀察S3的急性毒性。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，S3能抑制MCF-7細(xì)胞增殖，此作用可能與激

11、活β雌激素受體有關(guān)；S3給予最大給藥量10g/Kg時，小鼠觀察2周依然安全。因此S3為低毒性。
　　 綜上所述，本課題首次分別從體內(nèi)，體外實驗探討了S3對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，并建立了兩種不同AD動物模型，驗證了木豆葉芪類成分及其合成類似物S3改善AD模型大、小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，并初步探討了其作用機(jī)理。在此基礎(chǔ)上還發(fā)現(xiàn)S3可以改善高脂飼料喂養(yǎng)大鼠的血脂異常，改善膽固醇代謝紊亂及下調(diào)去卵巢大鼠海馬和皮質(zhì)AQP1