TFPI-2與RASSF1C相互作用及SOK1對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移的影響.pdf

1、組織因子途徑抑制物-2(tissuefactorpathwayinhibitor-2，TFPI-2)又稱胎盤蛋白-5(placerltaprotein-5，PP-5)和基質(zhì)相關(guān)絲氨酸蛋白酶抑制劑(matrixassociatedserineproteaseinhibitor，MSPI)，是一種帶有kunitz型結(jié)構(gòu)域的蛋白酶抑制劑，屬于絲氨酸蛋白酶抑制物超家族成員。成熟的人TFPI-2由富含酸性氨基酸的N端、三個(gè)串聯(lián)的kuntiz結(jié)構(gòu)域

2、和富含堿性氨基酸的C端組成，能抑制胰蛋白酶、纖溶酶、糜蛋白酶、血漿緩激肽釋放酶、組織蛋白酶G和多種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的活性，從而對(duì)抗多種惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。TFPI-2與同家族的組織因子途徑抑制物-1(TFPI-1)結(jié)構(gòu)相似，功能部分相同，也是一種重要的抗凝物質(zhì)，對(duì)凝血因子Ⅶa(FⅦa)/組織因子(tissuefactor，TF)復(fù)合物和凝血因子Xa(FXa)等均有不同的抑制作用。但迄今為止，TFPI-2的生理功能尚不清楚，TF

3、PI-2與其它蛋白質(zhì)相互作用的信息也知之有限。
　　我們運(yùn)用Matchmaker3酵母雙雜交系統(tǒng)，構(gòu)建了pGBKT7/TFPI-2質(zhì)粒載體。以此質(zhì)粒為誘餌，從人胎腦cDNA文庫中篩選出了95個(gè)蛋白編碼基因，包括32個(gè)代謝相關(guān)基因(其中8個(gè)參與蛋白代謝，13個(gè)參與核酸代謝，11個(gè)參與糖代謝)，21個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因，5個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)與生存相關(guān)基因，7個(gè)運(yùn)輸相關(guān)基因，2個(gè)抗調(diào)亡相關(guān)基因，其余28個(gè)基因的功能不明確。通過分析相關(guān)蛋白的細(xì)胞定

4、位、已知功能及文庫載體在雙雜交系統(tǒng)中正確表達(dá)的可能性等，進(jìn)一步確定了8個(gè)可能與TFPI-2有潛在相互作用的蛋白。
　　在此研究基礎(chǔ)上，我們選擇了RASSF1C和ASB兩個(gè)蛋白，以確定它們與TFPI-2是否存在相互作用。ASB蛋白在成功拷貝基因，用PCR檢測(cè)了36個(gè)陽性克隆均無目的條帶。故我們將研究重點(diǎn)集中在確定TFPI-2是否與RASSF1C是否存在相互作用。
　　我們采用不同顏色的熒光表達(dá)載體，分別構(gòu)建了TFPI-2和RA

5、SSF1C的表達(dá)載體(融合表達(dá))，激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)兩者存在共定位，免疫共沉淀方法確定TFPI-2與RASSF1C存在相互作用。
　　絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Ste20家族涉及多種信號(hào)通路，包括參與控制細(xì)胞遷移和極性的信號(hào)通路。Ste20家族可分為p21活化蛋白激酶(p21-activatedkinases)和生發(fā)中心激酶(germinalcenterkinases，GCK)兩個(gè)亞家族。GCK可進(jìn)一步分為八個(gè)亞群，其中2和3亞

6、群包括哺乳動(dòng)物Ste20(mst)蛋白激酶、MST1、MST2、MST3、MST4和酵母Sps1/Ste20相關(guān)激酶1(YSK1，哺乳動(dòng)物同源基因?yàn)镾OK1)。YSK1也被稱為Ste20氧化應(yīng)激反應(yīng)蛋白激酶1，可被活性氧中間體弱激活，但不能由任何其它環(huán)境壓力，或生長(zhǎng)因子激活。然而，該激酶不參與任何已知的蛋白激酶(MAPK)通路，且YSK1的生理功能不明。同YSK1一樣，MST4過表達(dá)不能激活JNK和p38激酶途徑，但可促進(jìn)非錨定依賴性增