新基因CIAPIN1的功能研究.pdf

1、CIAPIN1是本實驗室2000年通過抑制性消減雜交（SSH）、差異顯示技術(shù)（DD-PCR）及雙向電泳（2-DE）的方法篩選胃癌多藥耐藥（MDR）相關(guān)分子時得到的一個結(jié)構(gòu)與功能均未明確的新基因，當(dāng)時命名為V62。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)V62基因在SGC7901/VCR耐藥細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)(1)，提示其可能在胃癌MDR中發(fā)揮重要作用。
　　2004年，Shibayama等報道了V62在小鼠體內(nèi)同源分子Anamorsin的研究。Anamo

2、rsin可介導(dǎo)小鼠的前B細(xì)胞系Ba/F3抵抗細(xì)胞因子IL-3撤除所致凋亡(2)。V62與小鼠Anamorsin在氨基酸序列上有88％的同源性，為不同種屬的同源分子。2004年，國際基因命名委員會將該基因統(tǒng)一命名為CIAPIN1，即細(xì)胞因子誘導(dǎo)的凋亡抑制因子1，V62亦即獲得了正式的命名——CIAPIN1。
　　目前新基因CIAPIN1的基本生物學(xué)功能尚未明確，為了后續(xù)實驗順利進(jìn)行，本實驗室于2005年率先在國際上成功制備了CIAP

3、IN1鼠源性單克隆抗體，并申請專利保護(hù)。本課題將對CIAPIN1蛋白在人體多器官組織內(nèi)的表達(dá)分布，CIAPIN1基因抗凋亡的機制、與惡性腫瘤發(fā)生的關(guān)系及如何參與體內(nèi)復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)等進(jìn)行初步探討，以明確新基因CIAPIN1的基本生物學(xué)功能。
　　【目的】：
　　1、研究CIAPIN1蛋白在人和小鼠發(fā)育不同階段多器官組織中表達(dá)分布的特點及趨勢，為進(jìn)一步研究其基本生物學(xué)功能提供新的思路和實驗依據(jù)；2、檢測驗證CIAPIN1分子

4、的亞細(xì)胞定位，為其生物學(xué)功的闡明提供重要線索；3、探討CIAPIN1介導(dǎo)胃癌MDR的機制；4、構(gòu)建并包裝CIAPIN1腺病毒系列載體及病毒，以利于下一步細(xì)胞學(xué)實驗；5、研究CIAPIN1與胃癌發(fā)生的相關(guān)性；6、篩選CIAPIN1下游效應(yīng)分子；7、初步篩選CIAPIN1相互作用分子。
　　【方法】：
　　1、用抗CIAPIN1單克隆抗體，對小鼠出生后P0、P7、P14、P21和P28天心、腦、肝、腎和骨骼肌的組織石蠟連續(xù)切片、

5、人孕5個月胚胎多器官組織石蠟連續(xù)切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測；分析CIAPIN1蛋白在成年鼠及成人多器官組織中的表達(dá)趨勢；2、采用免疫組織化學(xué)和免疫熒光檢測、EGFP-CIAPIN1融合蛋白表達(dá)及亞細(xì)胞器分離等方法觀察CIAPIN1在多種體外培養(yǎng)細(xì)胞系內(nèi)的亞細(xì)胞定位；3、利用體外藥物敏感試驗、阿霉素蓄積與潴留試驗、阿霉素誘導(dǎo)凋亡試驗、WesternBlot等研究CIAPIN1對胃癌MDR的影響；4、構(gòu)建CIAPIN1正義及siRNA腺病毒載

6、體，利用包裝的腺病毒感染胃癌SGC7901和MKN45細(xì)胞系，檢測CIAPIN1對胃癌惡性生物學(xué)行為的影響；5、利用2-DE和質(zhì)譜技術(shù)鑒定CIAPIN1上調(diào)和下調(diào)的蛋白質(zhì)；6、通過基因芯片技術(shù)篩選CIAPIN1相關(guān)的差異表達(dá)基因；7、利用串聯(lián)親和純化（TAP）和質(zhì)譜技術(shù)檢測CIAPIN1相互作用分子。
　　【結(jié)果】：
　　1、CIAPIN1蛋白在出生后不同時間點小鼠多器官組織內(nèi)的表達(dá)
　　在剛出生小鼠P0的心、腦、肝、

7、腎和骨骼肌中，可見不同程度的CIAPIN1陽性免疫反應(yīng)物，尤其在心肌和骨骼肌中最明顯，腦和腎臟次之，肝臟最弱；CIAPIN1陽性反應(yīng)物主要定位于心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞，幾乎所有的腦細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞（主要在髓質(zhì)腎小管）及部分肝細(xì)胞。
　　總體來看，從P0到P7，CIAPIN1陽性反應(yīng)物強度在心、腦、肝、腎和骨骼肌中變化逐漸加強。從P7到P14，CIAPIN1陽性反應(yīng)物在肝、腎、骨骼肌中略有降低；在心肌、中腦和小腦中有增強。從P14

8、到P21，CIAPIN1陽性反應(yīng)物在心、腦、肝、腎和骨骼肌中變化略有減弱。從P21到P28，CIAPIN1陽性反應(yīng)物在心、腦、肝和骨骼肌中進(jìn)一步減弱；此時，隨著腎皮質(zhì)進(jìn)一步增厚，在髓質(zhì)和皮質(zhì)腎小管均可見明顯的CIAPIN1陽性反應(yīng)物，CIAPIN1陽性反應(yīng)物在腎臟中增加；在這段時期，CIAPIN1陽性反應(yīng)物在皮質(zhì)腎小管比髓質(zhì)腎小管更明顯。然而，在3個月大的成年鼠中，CIAPIN1陽性反應(yīng)物在心、腦、肝和腎小管中的表達(dá)強度要低于P28小鼠

9、；但CIAPIN1陽性反應(yīng)物在成年鼠骨骼肌中較P28小鼠高。
　　2、CIAPIN1蛋白在人5個月胚胎及成人多器官組織內(nèi)的表達(dá)
　　在人5月胚胎多器官組織中，CIAPIN1陽性反應(yīng)物見于心臟、膽囊單層柱狀上皮和粘膜、結(jié)腸粘膜、小腸粘膜和絨毛、肝臟、直腸腺體、胃粘膜、腎上腺束狀帶、甲狀腺濾泡、脾索、胸腺小葉間隔、皮膚真皮層和汗腺、睪丸白膜和間質(zhì)、腦組織內(nèi)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)、肺小支氣管和肺泡、骨骼肌、腎臟皮髓質(zhì)和腎小管、子宮內(nèi)膜、

10、胰腺腺泡和胰島、卵巢、輸卵管粘膜等絕大多數(shù)組織細(xì)胞。與CIAPIN1在5個月胚胎器官組織中的表達(dá)水平相比，幾乎所有被檢測的內(nèi)、外胚層發(fā)育而來的成人器官組織內(nèi)CIAPIN1蛋白的表達(dá)水平相對其5個月胚胎器官組織中的表達(dá)水平有不同程度下降，如肝、胰腺、腦、神經(jīng)系統(tǒng)等；在中胚層發(fā)育而來的成人器官組織內(nèi)CIAPIN1蛋白的表達(dá)水平相對其5個月胚胎器官組織中的表達(dá)水平有不同程度增強，如腎、肌肉、結(jié)締組織等；但極個別器官組織例外，有待進(jìn)一步證實。<

11、br>　　3、CIAPIN1在細(xì)胞內(nèi)廣泛分布于胞漿、胞核并富集于核仁
　　我們采用免疫熒光染色、免疫組織化學(xué)染色及EGFP-CIAPIN1融合蛋白表達(dá)等方法觀察了CIAPIN1在多種體外培養(yǎng)細(xì)胞系包括小鼠成纖維細(xì)胞系NIH3T3、人腫瘤細(xì)胞系和永生化細(xì)胞系內(nèi)的分布，發(fā)現(xiàn)CIAPIN1在胞漿、胞核均有分布，而核仁為CIAPIN1的濃集部位。為進(jìn)一步確證以上結(jié)果，通過HepG2亞細(xì)胞成分的分離，用WesternBlot方法檢測了CIA

12、PIN1在各亞細(xì)胞成分內(nèi)的分布，結(jié)果與免疫學(xué)方法和EGFP融合表達(dá)所得到的結(jié)果一致。上述結(jié)果提示：CIAPIN1在細(xì)胞內(nèi)可能經(jīng)歷胞漿－胞核－核仁轉(zhuǎn)位過程，而核仁可能是CIAPIN1發(fā)揮生物學(xué)功能的最終部位或部位之一。另一種可能是，核仁是CIAPIN1的重要儲存場所，通過儲存和釋放調(diào)節(jié)CIAPIN1在不同時期的作用。
　　4、CIAPIN1介導(dǎo)胃癌MDR
　　前期本實驗室研究發(fā)現(xiàn)CIAPIN1基因在胃癌SGC7901/VCR細(xì)

13、胞內(nèi)表達(dá)上調(diào)(1)。我們進(jìn)而采用WesternBlot的方法證實CIAPIN1能上調(diào)P-gp的表達(dá)和Bcl-2/Bax的相對比率；基因轉(zhuǎn)染、siRNA技術(shù)、阿霉素蓄積與潴留試驗、藥敏實驗顯示：CIAPIN1的特異性siRNA轉(zhuǎn)染后可有效逆轉(zhuǎn)胃癌MDR表型。這些結(jié)果提示抑制細(xì)胞對抗癌藥物外排，抵抗化療藥物誘導(dǎo)的凋亡，可能是CIAPIN1介導(dǎo)腫瘤MDR的重要機制。
　　5、CIAPIN1正義及siRNA腺病毒
　　腺病毒是目前最

14、常用的基因運載工具，有安全、高效、穩(wěn)定等優(yōu)點，為了進(jìn)一步研究CIAPIN1在惡性腫瘤中的功能和具體的分子機制；我們應(yīng)用腺病毒載體試劑盒，成功構(gòu)建并包裝了CIAPIN1及CIAPIN1-siRNA系列腺病毒，實驗證明它可以有效感染腫瘤細(xì)胞，干預(yù)細(xì)胞內(nèi)CIAPIN1表達(dá)，為下一步實驗奠定良好基礎(chǔ)。
　　6、CIAPIN1抑制胃癌生長和成瘤
　　本實驗室前期通過免疫組化法檢測了CIAPIN1蛋白在胃癌組織與其癌旁組織中的表達(dá)，結(jié)果

15、顯示：CIAPIN1在胃癌組織中的表達(dá)顯著低于相應(yīng)的癌旁組織及正常胃粘膜；CIAPIN1在胃癌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平低于永生化人胃粘膜細(xì)胞系GES-1；其中以SGC7901和MKN45細(xì)胞系比較顯著。我們分別將腺病毒Ad-CIAPIN1、Ad-CIAPIN1siRNA及其對照空病毒分別感染SGC7901和MKN45細(xì)胞，觀察CIAPIN1對胃癌SGC7901和MKN45細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響。結(jié)果顯示：(1)Ad-CIAPIN1可以上調(diào)CI

16、APIN1在SGC7901和MKN45細(xì)胞中的表達(dá)，Ad-CIAPIN1siRNA可以顯著抑制CIAPIN1在上述兩種細(xì)胞系中的表達(dá)；(2)上調(diào)CIAPIN1表達(dá)可抑制SGC7901和MKN45細(xì)胞的生長，下調(diào)CIAPIN1表達(dá)可促進(jìn)SGC7901和MKN45細(xì)胞的生長；(3)CIAPIN1可以抑制胃癌SGC7901和MKN45細(xì)胞體外錨定非依賴成長能力；(4)CIAPIN1可抑制SGC7901和MKN45細(xì)胞的體內(nèi)成瘤；(5)CIAP

17、IN1抑制胃癌SGC7901和MKN45細(xì)胞增殖的機制，部分是通過下調(diào)CyclyinD1的表達(dá)，上調(diào)P27的表達(dá)，抑制細(xì)胞周期G1進(jìn)展實現(xiàn)的。上述結(jié)果提示，CIAPIN1在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。
　　7、CIAPIN1下游信號分子的篩選
　　在相似條件下分別對來自SGC7901-pSiCIAPIN1及其對照SGC7901-pSi的總蛋白樣品重復(fù)進(jìn)行了3次2-DE，從肉眼觀察發(fā)現(xiàn)相同樣品的3次2-DE圖譜基本一致。圖譜中

18、蛋白質(zhì)分子大小主要集中在20kd至100kd之間。利用Melanie32-D分析軟件分析，發(fā)現(xiàn)CIAPIN1能夠上調(diào)SGC7901細(xì)胞內(nèi)13個蛋白的表達(dá)，下調(diào)其中7個蛋白的表達(dá)。我們對這20個蛋白質(zhì)斑點進(jìn)行了膠內(nèi)酶解和MALDI-TOF-MS肽指紋圖譜分析，結(jié)果成功確定了8個差異表達(dá)蛋白。它們分別是P66、If-A20、Twist、IGHD、CACNA1B、GSDM1、IFT20和RGS，其中P66、RGS、Twist、CACNA1B、

19、GSDM1和IGHD為CIAPIN1所上調(diào)，IFT20和If-A20為CIAPIN1所下調(diào)。然而，這一結(jié)果還需要WesternBlot進(jìn)行進(jìn)一步驗證。
　　經(jīng)過Trizol法抽提SGC7901-pc和SGC7901-pCIAPIN1細(xì)胞的總RNA，瓊脂糖檢測和Lab-on-Chip分析表明：所提取的RNA無明顯降解，RNA的質(zhì)和量符合基因芯片測定的要求。經(jīng)過RNA純化、熒光探針的制備純化及定量、芯片雜交、圖像采集及數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化等步驟

20、，發(fā)現(xiàn)芯片的雜交信號強度較高，片內(nèi)信號均一，14,000個雜交點的質(zhì)控點變異系數(shù)（CV）均值為12.4％，芯片雜交點的檢出率為84.6％。以兩種細(xì)胞信號強度的比值小于0.5或者大于2為標(biāo)準(zhǔn)判定差異表達(dá)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照的SGC7901-pc細(xì)胞相比，SGC7901-pCIAPIN1細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)的基因有411個，下調(diào)表達(dá)的基因有288個。
　　8、CIAPIN1相互作用分子的篩選
　　Rigaut等于1999年描述了一種

21、新型的用于純化蛋白復(fù)合物的親和層析策略（TAP）策略。在此，我們采用TAP與質(zhì)譜技術(shù)連用檢測CIAPIN1相互作用的蛋白復(fù)合物，我們成功構(gòu)建了CIAPIN1分子C末端融合表達(dá)TAP標(biāo)簽的真核表達(dá)載體，瞬時轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞，通過質(zhì)譜分析首次檢測到了一個與CIAPIN1相互作用的分子TXNL2。雖然TXNL2作為另外一個功能未知新基因的未能為CIAPIN1基本功能的闡明提供有力支持，但是我們在本研究中建立的CIAPIN1特異的哺乳動物