基于Pyrosequencing技術的乙型肝炎病毒(HBV)耐藥變異檢測試劑盒性能評價和臨床試用.pdf

1、本研究分為兩部分:1、試劑盒性能評價①構建包含十個常見已知的NAs相關耐藥變異標準質粒,并用之對試劑盒性能進行評價。②兩種方法(雙脫氧測序法和焦磷酸測序法)檢測95份CHB患者血清,兩者結果不相符者進行克隆測序法驗證并對試劑盒性能進行評價。2、試劑盒臨床試用對119例急性乙肝患者感染乙型肝炎病毒多聚酶區(qū)(HBV RT)自然變異株檢測并分析。
　　 第一部分基于Pyrosequencing技術的乙型肝炎病毒(HBV)耐藥變異檢測試

2、劑盒性能評價
　　 目的：早期檢測到耐藥突變可以指導藥物的挽救治療。本研究的目的是評價基于Pyrosequencing(焦磷酸測序)技術的乙型肝炎病毒常見耐藥變異檢測試劑盒性能(靈敏度、特異性和可重復性等)。
　　 方法：1、構建包含十個常見NAs相關耐藥變異位點標準質粒,并對以上質粒加以鑒定和定量。2、不同濃度、不同比例混合的質粒樣本對試劑盒性能驗證。3、服用NAs類藥物單藥或聯(lián)合治療治療應答不良患者的慢性乙型肝炎患者

3、血清及未用過NAs藥物治療的CHB患者為研究對象,分別用雙脫氧測序法和焦磷酸測序法對患者感染HBV-DNA進行序列分析,對兩種檢測結果不符合樣本再進行TA-克隆測序法進行分析,驗證所開發(fā)研制的基于Pyrosequencing檢測平臺HBV耐藥突變檢測試劑盒的性能(靈敏度、特異性和可重復性等)。
　　 結果：1、獲得包含I169T、V173L、L180M、A181V、T184G、A194T、S202I、M204V、N236T、M2

4、50V等十個常見NAs相關耐藥變異位點序列標準質粒和A181T、M204I和野生型序列質粒。通過PCR鑒定、酶切鑒定、雙脫氧測序和焦磷酸測序鑒定明確插入片段的系列與預期一致。2、試劑盒性能評價(敏感度、特異性和可重復性評價)標準質粒梯度稀釋及標準質粒不同濃度混合后使用試劑盒及臨床待檢血清進行PCR擴增、焦磷酸測序,結果顯示:1000copes/ml滴度水平以上的標準質粒及HBV-DNA1000copes/ml滴度水平以上HBV-DNA(

5、+)血清標本均獲得了有效擴增,陽性率達100％；擴增后產(chǎn)物進行測序焦磷酸法測序結果與Sanger法測序結果的符合率為100％。在1000copes/ml滴度水平不同比例(野生型和突變型)混合的質粒的測序結果:變異株質粒占總質?！?0％時焦磷酸測序法檢測出來陽性率達100％；在1000copes/ml滴度水平變異型質粒占總質粒10％使用試劑盒對分別進行10—20次重復焦磷酸測序,其測序結果符合率為100％；焦磷酸測序法和直接測序法檢測我國

6、常見B基因和C基因型HBV病毒株感染的CHB患者血清標本95例,對兩者結果符合率進行分析,兩者完全符合率88.4％(84/95),同時評價所開發(fā)研制的基于Pyrosequencing檢測平臺HBV耐藥突變檢測試劑盒的性能。
　　 結論：所研發(fā)的基于焦磷酸測序法HBV耐藥突變檢測試劑盒可以特異性擴增我國常見B基因和C基因型HBV病毒株,擴增效率高,保證Pyrosequencing整個檢測體系的特異性與靈敏度。充分發(fā)揮Pyroseq

7、uencing技術平臺檢測結果準確,檢測位點靈活的特點。
　　 第二部分基于Pyrosequencing技術的HBV耐藥變異檢測試劑盒臨床試用-急性乙肝病毒感染者中核苷(酸)類似物相關耐藥準種的檢測分析
　　 目的：了解急性乙型肝炎病毒感染者中HBV聚合酶區(qū)核苷(酸)類似藥物相關耐藥變異準種的分布情況。
　　 方法：收集119例HBV DNA陽性急性乙型肝炎患者血清,分別采用巢式PCR產(chǎn)物直接測序、焦磷酸測序和T

8、A-克隆測序等方法對HBV聚合酶區(qū)(RT)與核苷(酸)類藥物耐藥相關的常見突變位點(rt169、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt236和rt250等)進行檢測分析。
　　 結果：PCR產(chǎn)物直接測序法檢出感染HBV耐藥變異株患者6例(5.04％),分別為rtM204I1例、rtM204V2例以及rtA181V3例；焦磷酸測序法在上述6例病人的基礎上共檢測出9例耐藥準種感染(r