SFTSV核酸檢測(cè)試劑盒國(guó)家參考品的研制和乙型腦炎病毒E蛋白的研究.pdf

1、第一部分發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒核酸檢測(cè)試劑盒國(guó)家參考品的研制
　　【目的】發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒（SFTSV）是首次在中國(guó)出現(xiàn)并由國(guó)內(nèi)專家分離到的一種新病毒，病死率高達(dá)10％。目前針對(duì)該病毒尚無(wú)有效的疫苗和藥物。為了有效控制該疾病傳播，對(duì)其快速、準(zhǔn)確診斷是基礎(chǔ)。市場(chǎng)上出現(xiàn)了各種檢測(cè)試劑盒，但尚無(wú)關(guān)于 SFTSV檢測(cè)試劑盒的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品。為了對(duì)此類試劑盒等進(jìn)行科學(xué)有效的質(zhì)量控制，本文研制了SFTSV核酸檢測(cè)試劑盒的

2、國(guó)家參考品。
　　【方法】本研究按照國(guó)家參考品建立的相關(guān)規(guī)定和 SFTSV的生物學(xué)特點(diǎn)，分別篩選出符合要求的陽(yáng)性參考品和陰性參考品，并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證和熒光定量PCR驗(yàn)證進(jìn)行確認(rèn)，確保參考品的準(zhǔn)確性和特異性。在此基礎(chǔ)上，將陽(yáng)性參考品HB29株病毒系列稀釋，以此考察試劑盒的最低檢出限，從而確定參考品的靈敏度，并通過(guò)檢測(cè)稀釋至104U/mL的HB29株病毒Ct值的變異系數(shù)來(lái)確定參考品的精密度。本研究建立的參考品已組織不同實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定

3、，以確定參考品的特性值。參考品完成之后進(jìn)行不同溫度和反復(fù)凍融條件下的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，考察參考品的穩(wěn)定性。
　　【結(jié)果】根據(jù)參考品應(yīng)具有的廣譜性和代表性最終確定了6株陽(yáng)性參考品和5株陰性參考品，基因測(cè)序和熒光定量 PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)均證明了參考品的準(zhǔn)確性。通過(guò)對(duì)SFTSV HB29株病毒系列稀釋后的最低檢出限實(shí)驗(yàn)，結(jié)合臨床上病人血清的病毒載量，確定102U/mL的病毒量作為參考品的最低檢出限，即含量為102U/mL必須檢測(cè)為陽(yáng)性，低于102

4、U/mL不作要求。結(jié)合各個(gè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果，確定本精密度參考品的Ct值的變異系數(shù)應(yīng)不高于5.0%。協(xié)作標(biāo)定各實(shí)驗(yàn)室結(jié)果均與本實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明本參考品在不同溫度和反復(fù)凍融條件下穩(wěn)定性良好。目前本參考品已通過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)委員會(huì)批準(zhǔn)，作為 SFTSV核酸檢測(cè)試劑盒國(guó)家第一代參考品，其批準(zhǔn)文號(hào)為：（2015）國(guó)生參字0065。
　　【結(jié)論】本研究建立了SFTSV核酸檢測(cè)試劑盒國(guó)家參考品，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)尚無(wú)SFTSV相關(guān)參

5、考品的空缺，能夠?qū)z測(cè)試劑盒進(jìn)行良好的質(zhì)量控制，保證試劑盒能快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出病人血清中的SFTSV，從而更加科學(xué)有效的促進(jìn)SFTSV的預(yù)防控制工作。
　　第二部分乙型腦炎病毒E蛋白的研究
　　【目的】乙型腦炎（JE）減毒活疫苗SA14-14-2是我國(guó)自主研發(fā)的一種疫苗，對(duì)乙腦的流行和控制起著重要作用，自投產(chǎn)以來(lái)在國(guó)內(nèi)外得到廣泛應(yīng)用。為了從分子、原子水平探討乙型腦炎減毒株 SA14-14-2弱毒力穩(wěn)定、免疫原性良好的理論基礎(chǔ)，

6、解析JEV SA14-14-2蛋白中與病毒毒力和免疫原性相關(guān)的病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。通過(guò)原核表達(dá)獲得乙腦病毒E蛋白，通過(guò)X射線衍射技術(shù)，對(duì)該蛋白晶體進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，結(jié)合不同的乙腦病毒E蛋白的生物學(xué)功能，探索JEV SA14-14-2的免疫原性和減毒機(jī)理。
　　【方法】本研究將原核表達(dá)載體pQE C3與乙腦病毒E基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，驗(yàn)證正確后導(dǎo)入到受體菌 BL21內(nèi)，以 IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，高壓破碎細(xì)菌后收獲 E蛋白包涵體。再通過(guò)鎳柱親

7、和層析、折疊復(fù)性和凝膠過(guò)濾層析對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化。獲得的目的蛋白一部分用于晶體結(jié)構(gòu)解析，另一部分以不同劑量（80μg/只、120μg/只）免疫 Balb/c小鼠，分別進(jìn)行免疫攻擊保護(hù)力實(shí)驗(yàn)和血清中和抗體檢測(cè)，以解析其生物學(xué)功能。
　　【結(jié)果】原核表達(dá)載體pQE C3與乙腦病毒包膜糖蛋白E基因連接完成，獲得了重組載體，轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌BL21內(nèi)，并鑒定正確，獲得了陽(yáng)性克隆。用 LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)后收獲目的蛋白包涵體，經(jīng)過(guò)復(fù)性

8、、純化后獲得 JEV SA14-14-2、SA14-5-3、SA14-9-7 E蛋白，其中一部分蛋白用于E蛋白晶體結(jié)構(gòu)解析，獲得了晶體。另一部分進(jìn)行E蛋白免疫原性研究，結(jié)果顯示，SA14-14-2 E蛋白免疫后中和抗體水平最高，達(dá)1:23，血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率達(dá)100%。中和抗體水平和血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率高低趨勢(shì)均為 SA14-14-2>SA14-5-3>SA14-9-7，與三株病毒原型株的免疫原性高低趨勢(shì)相符。E蛋白保護(hù)力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示三組蛋白均呈現(xiàn)出一定

9、的保護(hù)力，但差異不明顯。
　　【結(jié)論】本研究通過(guò)原核表達(dá)收獲乙型腦炎病毒E蛋白，為深入研究該蛋白生物學(xué)功能和晶體結(jié)構(gòu)解析提供了條件，進(jìn)一步為解析乙腦病毒的致病機(jī)理、乙腦減毒活疫苗毒株 SA14-14-2的減毒機(jī)理和疫苗的質(zhì)量控制奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。SA14-14-2 E蛋白的中和抗體水平結(jié)果表明其蛋白的免疫原性高于SA14-5-3和SA14-9-7，這與三株病毒的免疫原性下降趨勢(shì)相符，推測(cè)E蛋白是影響乙腦病毒的免疫原性改變的關(guān)鍵蛋白。