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文檔簡介
1、第一部分髓鞘堿性蛋白主動免疫:上調(diào)效應(yīng)性T胞的免疫應(yīng)答,促進(jìn)出血性卒中大鼠的康復(fù) 目的:應(yīng)用髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)對實驗性腦出血大鼠進(jìn)行免疫注射,通過測定大鼠腦組織中的神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的表達(dá),觀察MBP對出血性卒中
2、的保護(hù)作用。同時測定脾臟中某種免疫性T細(xì)胞的特異性基因片段的表達(dá),探討MBP神經(jīng)保護(hù)作用的機制。 方法: 1動物分組及飼養(yǎng):健康成年雌性SD大鼠,90只,體重300a±20g。造模成功(Longa五級評分大于2分者視為成功)后隨機分為MBP免疫組、磷酸鹽緩沖鹽水(phosphatebuffered saline,PBS)組、卵白蛋白(ovalbumin,OVA)組每組各30只,各組分為1d,3d,7d,14d,21d,五
3、個亞組,每亞組6只。其中PBS組和OVA組為MBP免疫組的對照組。為同一條件下飼養(yǎng)。 2動物模型及取材:大鼠腹腔注射麻醉后,在尾動脈抽取動脈血,應(yīng)用立體定位技術(shù),在鼠腦的右側(cè)基底節(jié)區(qū)注射自體尾動脈血50μl模。麻醉清醒后參照Longa五級評分法[1]評分,立即用不完全性弗氏佐劑乳化的MBP、OVA、PBS在相應(yīng)組別大鼠的腳蹼進(jìn)行皮下注射。每天進(jìn)行Longa評分,不同亞組按相應(yīng)時間點取材。常規(guī)麻醉,胸腹腔聯(lián)合切開,結(jié)扎脾臟動靜脈后
4、,摘脾存于-80℃液氮中。暴露大鼠的心臟,經(jīng)左心室插管,用4%多聚甲醛0.1 mol/L等灌注固定后迅速斷頭取腦,取腦出血周圍組織,在4%的多聚甲醛中固定24h后,進(jìn)行酒精梯度脫水,二甲苯透明、浸蠟,石蠟包埋。 3.結(jié)果測定:a.免疫組化取出血腫周圍腦組織,分別進(jìn)行GFAP和BDNF的免疫組化檢查。b.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PC
5、R)取脾組織制作勻漿,提取RNA,RT-PCR產(chǎn)物半定量,用UVP凝膠圖像成像系統(tǒng)拍攝打印實驗結(jié)果,用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。計算Foxp3與β-actin的相對密度值,以此代表目的片斷的相對表達(dá)值。 4 數(shù)據(jù)資料以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間兩兩比較采用單因素方差分析LSD檢驗;腦組織免疫組化結(jié)果比較采用秩和檢驗。統(tǒng)計數(shù)據(jù)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件處理,P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果: 1.MBP組大鼠與OV
6、A組及PBS組在對應(yīng)時間點應(yīng)用Longa氏五級評分法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分,顯示前者高于后兩者并有顯著差異(P<0.05),而且MBP組大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)時間較對照組早,OVA組與PBS組比較未見顯著差異; 2.GFAP和BDNF的表達(dá),二者在各組中均為第一天最高,之后各天逐漸下降。但MBP組均高于相應(yīng)對照組(GFAP指標(biāo)P<0.01,BDNF指標(biāo)P<0.05),說明效應(yīng)性T細(xì)胞活性增加。OVA組與PBS組比較未見顯著差異;
7、 3.Foxp3mRNA在MBP干預(yù)組干預(yù)組的大鼠脾臟中的表達(dá)與相應(yīng)的對照組比較,均表達(dá)減低,且有明顯差異(P<0.01)。OVA組與PBS組比較未見顯著差異; 結(jié)論: 1.MBP對實驗性腦出血后大鼠的行為學(xué)缺損有治療作用,可減輕癥狀。 2.MBP能上調(diào)BDNF,GFAP蛋白表達(dá)水平,對血腫周邊神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)作用,3 MBP對實驗性腦出血大鼠進(jìn)行干預(yù),降低FoxpmRNA的表達(dá)4 MBP的免疫保護(hù)機制是直接上調(diào)
8、CD4+Th1細(xì)胞的免疫應(yīng)答,并且下調(diào)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對CD4+Th1細(xì)胞的抑制作用。促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的恢復(fù)。 第二部分多巴胺:下調(diào)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞活性,促進(jìn)出血性卒中大鼠的恢復(fù) 目的:應(yīng)用Dopamine對實驗性腦出血大鼠進(jìn)行腹腔注射,觀察CD4+CD25+T細(xì)胞對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷恢復(fù)的抑制作用,研究多巴胺(Dopamine)對出血性卒中的神經(jīng)保護(hù)作用機制。 方法: 1.動物分
9、組及飼養(yǎng):健康成年雌性SD大鼠90只,體重300±20g,造模成功(Longa五級評分大于2分者視為成功)后隨機分為Dopamine治療組、生理鹽水(NS)對照組(N=30),各組分為1d,3d,7d,14d,21d,五個亞組,每組6只。同一條件下飼養(yǎng)。 2.動物模型及取材:大鼠腹腔注射麻醉后,在尾動脈抽取動脈血,應(yīng)用立體定位技術(shù),在鼠腦的右側(cè)基底節(jié)區(qū)注射自體尾動脈血50μl造模。麻醉清醒后參照Longa五級評分法[1]評分,立
10、即用Dopamine和生理鹽水給相應(yīng)組別大鼠進(jìn)行腹腔注射。每天進(jìn)行Longa評分,不同亞組按相應(yīng)時間點取材。常規(guī)麻醉,胸腹腔聯(lián)合切開,接扎脾臟動靜脈后,摘脾存于-80℃液氮中。暴露大鼠的心臟,經(jīng)左心室插管,用4%多聚甲醛0.1 mol/L等灌注固定后迅速斷頭取腦,取腦出血周圍組織,在4%的多聚甲醛中固定24h后,進(jìn)行酒精梯度脫水,二甲苯透明、浸蠟,石蠟包埋。 3.結(jié)果測定:a.免疫組化取出血周圍腦組織,分別測GFAP(膠質(zhì)纖維酸
11、性蛋白)和BDNF(腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子)的免疫組化評分。b.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ReverseTranscription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR、)取脾組織制作勻漿,提取RNA, RT-PCR產(chǎn)物半定量,用UVP凝膠圖像成像系統(tǒng)拍攝打印實驗結(jié)果,用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。計算Foxp3與β-actin的相對密度值,以此目的片斷的相對表達(dá)值,表達(dá)CD4+CD25+T細(xì)胞的活性。 4
12、數(shù)據(jù)資料以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間兩兩比較采用t檢驗;腦組織免疫組化評分比較采用秩和檢驗。統(tǒng)計數(shù)據(jù)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件處理,P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果: 1.Dopamine組大鼠與NS組在對應(yīng)時間點應(yīng)用Longa氏五級評分法[1]進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分,結(jié)果顯示前者高于后兩者并有顯著差異(P<0.05),而且Dopamine組大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)時間較對照組早。 2.GFAP和BDNF在實驗大鼠腦中的
13、表達(dá),二者在各組中均為第一天最高,之后各天逐漸下降。Dopamine組均高于相應(yīng)對照組(P<0.01)。 3.Foxp3mRNA在Dopamine組的大鼠脾臟中的表達(dá)與相應(yīng)的對照組比較,均表達(dá)減低,且有明顯差異(P<0.01)。 結(jié)論: 1.CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的恢復(fù)有抑制作用。 2.在實驗性腦出血大鼠腦內(nèi)BDNE,GDNF蛋白表達(dá)增強,Dopamine能上調(diào)BDNF, GDN
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