血管內(nèi)皮DDAH-ADMA系統(tǒng)介導(dǎo)硝酸甘油耐受及（口山）酮的逆轉(zhuǎn)作用.pdf

1、研究背景 硝酸甘油是一種經(jīng)典的抗心絞痛藥物，其舒血管效應(yīng)是通過釋放一氧化氮(NO)，直接激活鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)使組織細胞中第二信使環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)生成增加所介導(dǎo)。然而，長期或反復(fù)使用硝酸甘油可產(chǎn)生耐受性，表現(xiàn)為其舒血管效應(yīng)減弱，其耐受產(chǎn)生的機制尚未完全闡明。近期研究顯示耐受可能與氧化應(yīng)激介導(dǎo)的硝酸甘油生物轉(zhuǎn)化關(guān)鍵酶－線粒體醛脫氫酶(ALDH-2)活性下降有關(guān)。 近來研究發(fā)現(xiàn)長期給予硝酸甘油能導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙

2、(endothelial dysfunction，ED)，其機制被認為與長期硝酸甘油處理造成內(nèi)源性一氧化氮合酶(NOS)功能障礙，NO生成減少有關(guān)。最近研究顯示，NOS抑制物非對稱性二甲基精氨酸(ADMA)能競爭性抑制NOS活性，減少NO的生成和抑制內(nèi)皮依賴性的血管舒張反應(yīng)。在多種病理生理的情況下ADMA水平顯著升高，并且能導(dǎo)致這些狀況下的血管內(nèi)皮功能不全，故被認為是一個新的內(nèi)皮功能不全的預(yù)測因子。因此，我們推測ADMA在硝酸甘油耐受所

3、致內(nèi)皮功能不全以及硝酸甘油耐受形成中發(fā)揮一定作用。 ADMA在體內(nèi)主要經(jīng)二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)水解。研究證明，DDAH活性下降所致的ADMA代謝減少是多種心血管疾病ADMA升高的主要原因。DDAH存在兩個亞型：DDAH1和DDAH2，其中 DDAH2主要分布于表達內(nèi)皮型NOS(eNOS)的組織包括血管內(nèi)皮。研究表明DDAH活性部位除可被氧化修飾調(diào)節(jié)外，還可被NO供體硝基化修飾調(diào)節(jié)，從而失去活性導(dǎo)致ADMA濃度積累增

4、高。故本實驗研究硝酸甘油耐受是否與DDAH活性下降和ADMA升高有關(guān)，并在此基礎(chǔ)上進一步探討其作用機制。 <口山>酮是普遍存在于植物中的一類多酚類化合物。研究顯示，一些劬酮化合物具明顯的抗氧化、抗炎及心臟保護作用。然而，<口山>酮對硝酸甘油耐受是否具有逆轉(zhuǎn)作用，尚未見報道。3,4,5,6-四羥基<口山>酮是我院藥物化學(xué)系合成的新型<口山>酮單體化合物。本實驗研究3，4，5，6-四羥基<口山>酮對硝酸甘油耐受是否具有逆轉(zhuǎn)作用，并在此基礎(chǔ)上

5、進一步探討其逆轉(zhuǎn)作用的機制。 該實驗分為二個部分：1)研究血管內(nèi)皮細胞 DDAH/ADMA 系統(tǒng)在硝酸甘油耐受形成中的作用，并探討其機制；2)研究<口山>酮對硝酸甘油耐受是否具有逆轉(zhuǎn)作用，并探討其作用是否與DDAH/ADMA系統(tǒng)有關(guān)。 方法 硝酸甘油耐受模型制備：在體大鼠硝酸甘油耐受經(jīng)皮下給予硝酸甘油(10 mg/kg)每天三次，連續(xù)八天誘導(dǎo)形成，離體大鼠血管硝酸甘油耐受由預(yù)先于浴槽中加入硝酸甘油(10μM)30

6、分鐘誘導(dǎo)形成，離體培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞硝酸甘油耐受由含硝酸甘油(10 μM)的培基孵育16小時誘導(dǎo)形成，分別觀察硝酸甘油舒血管效應(yīng)、降壓作用以及細胞內(nèi)cGMP水平變化。高表達DDAH2質(zhì)粒內(nèi)皮細胞的制備。觀察細胞內(nèi)cGMP水平變化；測定培養(yǎng)液中ADMA濃度(高效液相色．譜法)；測定內(nèi)皮細胞內(nèi)DDA[{的活性；檢測cGMP含量(放免法)，測定ROS水平(熒光分光光度法)，檢測內(nèi)皮細胞內(nèi)ALDH-2的活性(分光度法)。 結(jié)果 第

7、一節(jié)血管內(nèi)皮細胞 DDAH/ADMA系統(tǒng)介導(dǎo)硝酸甘油耐受 (1)在體大鼠，硝酸甘油產(chǎn)生降壓效應(yīng)，連續(xù)給予硝酸甘油(10mg/kg)8天后其降壓作用顯著減弱，血漿ADMA濃度也顯著增高，預(yù)先罐胃給予L-精氨酸(200 mg/kg)可恢復(fù)硝酸甘油的降壓效應(yīng)。 (2)離體胸主動脈，硝酸甘油引起濃度依賴性血管舒張，高濃度硝酸甘油(10μM)孵育血管環(huán)30 min后其舒血管作用顯著減弱，預(yù)先加入L-精氨酸(10 mM)可恢復(fù)硝酸甘

8、油的舒血管效應(yīng)。 (3)在培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞，高濃度硝酸甘油(10μM)孵育內(nèi)皮細胞16h后細胞內(nèi)ROS水平顯著升高，并伴有ALDH-2活性顯著降低以及硝酸甘油促cGMP合成作用減弱； L-精氨酸(1 mM)和N-乙酰半胱氨酸(10 mM)可以恢復(fù)細胞內(nèi)ROS、cGMP水平和ALDH活性。 (4)外源性給予 ADMA(1 μM)可顯著增加內(nèi)皮細胞內(nèi)的ROS水平。并顯著降低ALDH活性。L-精氨酸(1 mM)和N-乙酰半胱氨

9、酸(10 mM)可以恢復(fù)ROS水平和ALDH活性。 (5)高表達DDAH2細胞能顯著降低硝酸甘油耐受所誘的細胞內(nèi)ROS水平升高和恢復(fù)細胞內(nèi)ALDH活性。 第二節(jié) <口山>酮對硝酸甘油耐受的逆轉(zhuǎn)作用 (1)在體大鼠，硝酸甘油產(chǎn)生降壓效應(yīng)，連續(xù)給予硝酸甘油(10mg/kg)8天后其降壓作用顯著減弱，血漿ADMA濃度也顯著增高，預(yù)先罐胃給予 <口山>酮(60或90 mg/kg)可恢復(fù)硝酸甘油的降壓效應(yīng)。 (2

10、)離體胸主動脈，硝酸甘油引起濃度依賴性血管舒張，高濃度硝酸甘油(10μM)孵育血管環(huán)30 min后其舒血管作用顯著減弱，預(yù)先加入 <口山>酮(10或30μM)可恢復(fù)硝酸甘油的舒血管效應(yīng)。 (3)在培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞，高濃度硝酸甘油(10μM)孵育內(nèi)皮細胞16h后細胞內(nèi)ROS水平顯著升高，并伴有ALDH活性顯著降低以及硝酸甘油促cGMP合成作用減弱；<口山>酮(3或10μM)可以恢復(fù)細胞內(nèi)：ROS、cGMP水平和ALDH活性。