肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)肉雞血管內(nèi)皮祖細(xì)胞氧化損傷的逆轉(zhuǎn)作用.pdf

1、血管內(nèi)皮功能障礙是肺動(dòng)脈高壓發(fā)生過程中的重要環(huán)節(jié)，其機(jī)制主要包括內(nèi)皮損傷、內(nèi)皮修復(fù)失效以及血管完整性的破壞。EPCs是一群同時(shí)具有祖細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞特征的細(xì)胞。EPCs來源于骨髓，在血管損傷時(shí)，EPCs被動(dòng)員入血，并向血管受損部位歸巢，參與血管修復(fù)。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)是一種多功能因子，具有強(qiáng)大的促血管形成能力，在內(nèi)皮細(xì)胞上充當(dāng)促有絲分裂和促形態(tài)發(fā)生因子的角色。作為一種內(nèi)源性組織修復(fù)因子，HGF也具有抗細(xì)胞凋亡的作用。本研究的目的在于

2、建立家禽EPCs分離培養(yǎng)方法并探索HGF對(duì)ROS損傷的肉雞外周血EPCs功能的影響。
　　試驗(yàn)一，肉雞外周血EPCs的分離與鑒定。采用密度梯度離心分離出肉雞外周血單個(gè)核細(xì)胞，在EGM-2培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-48h后去掉未貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至7d時(shí)采用FITC-UEA-1和Dil-ac-LDL雙染色鑒定EPCs表型，至14d時(shí)采用PCR法檢測(cè)EPCs標(biāo)志CD133、VEGFR-2和CD31的表達(dá)，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，采用Ma

3、trigel實(shí)驗(yàn)檢測(cè)體外管形成能力。結(jié)果:EPCs在培養(yǎng)5-7d出現(xiàn)，呈梭形或不定形，能同時(shí)被FITC-UEA-1和Dil-ac-LDL染色，半定量PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR能檢測(cè)到細(xì)胞CD133、CD31以及VEGFR-2的mRNA的表達(dá)，但檢測(cè)不到CD34的表達(dá)，Matrigel實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞具有體外管形成的能力。
　　試驗(yàn)二，HGF對(duì)EPCs氧化損傷的逆轉(zhuǎn)作用。取培養(yǎng)至12d的EPCs，加入16.5mM氧自由基(ROS)發(fā)生器

4、2，2'-偶氮（2-甲基丙基脒）二鹽酸鹽(2-AAPH)孵育4h后，分別加入5、10和20ng/mL HGF并繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞，檢測(cè)增殖、凋亡以及遷移能力。結(jié)果:ROS處理顯著抑制EPCs增殖，誘導(dǎo)EPCs凋亡，并抑制EPCs的遷移。20ng/mL HGF可顯著促進(jìn)ROS損傷后的EPCs增殖，抑制ROS誘導(dǎo)的EPCs凋亡，提高ROS損傷細(xì)胞的遷移能力。
　　結(jié)論:
　　1、本研究建立起了肉雞外周血EPCs的分離培養(yǎng)方