自體滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞-小腸粘膜下層復(fù)合物修復(fù)兔半月板損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：以經(jīng)體外擴(kuò)增及細(xì)胞因子誘導(dǎo)后已進(jìn)入軟骨細(xì)胞分化譜系的兔自體渭膜間充質(zhì)干細(xì)胞(SMSCs)為種子，借助豬小腸粘膜下層(SIS)為支架，以SMSCs-SIS復(fù)合物的形式回植入兔體內(nèi)半月板缺損處，探討以此修復(fù)半月板損傷的可行性。 方法：通過有限稀釋單克隆培養(yǎng)法將兔SMSCs由滑膜組織中分離出來并加以純化，并進(jìn)一步在體外培養(yǎng)條件下研究其形態(tài)學(xué)、超微結(jié)構(gòu)、分子表型、增殖動(dòng)力學(xué)、核型以及致瘤性等基本的生物學(xué)特性；在體外用BMP-2、T

2、GF-β3和DEX協(xié)同刺激SMSCs后，以RT-PCR檢測(cè)Ⅰ、Ⅱ型膠原及軟骨特異性聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的mRNA表達(dá)，細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色檢測(cè)細(xì)胞分化過程中Ⅰ、Ⅱ型膠原的表達(dá)，堿性甲苯胺藍(lán)細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)軟骨特異性糖胺聚糖(GAG)的表達(dá)，借此判斷BMP-2、TGF-β3和DEX是否能夠誘導(dǎo)SMSCs進(jìn)入軟骨細(xì)胞分化譜系；采用Abraham方法處理SIS，并檢測(cè)其生物安全性和組織相容性，評(píng)價(jià)其作為種子細(xì)胞支架的可能性；最后將

3、經(jīng)體外擴(kuò)增及細(xì)胞因子誘導(dǎo)已進(jìn)入軟骨細(xì)胞分化譜系的SMSCs種植在SIS支架上，回植入體內(nèi)，6周、12周后取修復(fù)組織塊行HE染色，堿性甲苯胺藍(lán)染色，Ⅰ型、Ⅱ型膠原與S100蛋白的免疫化學(xué)組織染色，探討以此修復(fù)損傷半月板結(jié)構(gòu)和功能的可行性。 結(jié)果：在體外培養(yǎng)條件下兔SMS-Cs的增生分裂能力十分活躍，可以通過離體培養(yǎng)使其實(shí)現(xiàn)數(shù)目的擴(kuò)增；DNA含量檢測(cè)、染色體核型分析、荷瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SMSCs是正常的二倍體細(xì)胞，無致瘤性，可作為半

4、月板組織工程的種子細(xì)胞。在體外，SMSCs經(jīng)BMP-2、TGF-β3和DEX協(xié)同誘導(dǎo)后14天，RT-PCR檢測(cè)到Ⅰ型、Ⅱ型膠原及軟骨特異性聚集蛋白聚糖(aggrecan)mRNA的表達(dá)，細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色也證實(shí)有Ⅰ型、Ⅱ型膠原的表達(dá)，同時(shí)堿性甲苯胺藍(lán)細(xì)胞化學(xué)染色也證實(shí)有軟骨細(xì)胞特異性胞外基質(zhì)GAG成分，以上即證明SMSCs已進(jìn)入軟骨細(xì)胞分化譜系；本實(shí)驗(yàn)制成的SIS經(jīng)組織切片和掃描電鏡的觀察表明是一種海綿樣結(jié)構(gòu)，其表面及內(nèi)部均含有豐富的

5、微孔結(jié)構(gòu)，并與SMCSs有良好的組織相容性，可作為SMCSs的支架材料。SMSCs-SIS復(fù)合物植入半月板缺損區(qū)12周后大體觀察原半月板缺損區(qū)有半月板樣組織生成，HE染色可見纖維軟骨樣結(jié)構(gòu)，周圍膠原纖維結(jié)構(gòu)明顯，排列規(guī)則；堿性甲苯胺藍(lán)染色可見藍(lán)色異染基質(zhì)-GAG；Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原與S100蛋白的免疫化學(xué)組織染色呈強(qiáng)陽性。而膠原對(duì)照及空白對(duì)照組則僅見纖維組織樣的修復(fù)組織。 結(jié)論：利用自體SMSCs經(jīng)體外擴(kuò)增及細(xì)胞因子刺激后，以S