小腸黏膜下層組織和絲素蛋白-殼聚糖大孔微載體復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔耳廓軟骨缺損.pdf

1、目的： 一，建立含有轉(zhuǎn)化生長因子βi（TGF-β1）的促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的特殊誘導(dǎo)體系，研究在含有TGF-β1等特殊誘導(dǎo)成分培養(yǎng)條件下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的能力及其生物學(xué)特性。 二．探討采用5-2溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞技術(shù)，標(biāo)記誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形成的軟骨細(xì)胞的可行性。 三，探討通過Transwell技術(shù)共培養(yǎng)觀察兔軟骨細(xì)胞體外誘導(dǎo)采用BrdU標(biāo)記的人臍血間充

2、質(zhì)干細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞的可行性。 四，探討同種異體小腸黏膜下層支架復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞后修復(fù)兔耳廓軟骨缺損的可行性。 五，探討新型絲素蛋白/殼聚糖大孔微載體材料復(fù)合同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔耳廓軟骨缺損的可行性。 方法： 一．TGF-β1特殊軟骨誘導(dǎo)體系建立和觀察方法從兔脛骨結(jié)節(jié)內(nèi)側(cè)抽取骨髓，采用貼壁培養(yǎng)法分離純化兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并將其加入含有轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）和轉(zhuǎn)鐵蛋白

3、、胰島素、丙酮酸鈉等成分的特殊軟骨誘導(dǎo)體系進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；分別對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)14d后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及體外培養(yǎng)的第二代人鼻中隔軟骨細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和免疫組織化學(xué)DAB染色Ⅱ型膠原定性檢測。 二、誘導(dǎo)BrdU標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形成軟骨細(xì)胞方法將BrdU標(biāo)記過的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞按標(biāo)記時(shí)間的不同，采用臺(tái)盼藍(lán)標(biāo)記染色法計(jì)算出活細(xì)胞率，應(yīng)用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件單因素重復(fù)測量方法分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，比較標(biāo)記時(shí)間長短對(duì)兔骨髓間充質(zhì)細(xì)胞活

4、性有無顯著性差異；采用Transwell技術(shù)，將BrdU標(biāo)記過的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與體外培養(yǎng)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行非接觸式共培養(yǎng)，運(yùn)用免疫組化染色方法檢測共培養(yǎng)體系中兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化情況，觀察染色結(jié)果。 三．誘導(dǎo)BrdU標(biāo)記的人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞方法由足月順產(chǎn)分娩的新生兒臍靜脈穿刺抽取臍帶血，通過密度梯度法從臍帶血中獲得臍血間充質(zhì)干細(xì)胞并體外培養(yǎng)，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)細(xì)胞生長數(shù)量，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件

5、以單因素重復(fù)測量方法分析整個(gè)細(xì)胞生長周期各時(shí)間段是否存在顯著性差異，總結(jié)細(xì)胞分化生長規(guī)律；用BrdU標(biāo)記人臍血干細(xì)胞，采用Transwell技術(shù)將BrdU標(biāo)記的人臍血干細(xì)胞與兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞非接觸式共培養(yǎng)，誘導(dǎo)人臍血干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞，并用免疫組化染色方法進(jìn)行誘導(dǎo)后細(xì)胞類型鑒定。 四．同種異體兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞/小腸黏膜下層復(fù)合物修復(fù)兔耳廓缺損方法制備兔小腸黏膜下層；以TGF-β1誘導(dǎo)同種異體兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生成的軟骨細(xì)胞作為

6、種子細(xì)胞，經(jīng)過處理的同種異體兔片狀小腸黏膜下層作為支架材料，將軟骨細(xì)胞/小腸黏膜下層復(fù)合物在體外培養(yǎng)7d后種植于兔耳廓缺損處，分別于種植后4、10、16周于缺損區(qū)取材行大體觀察和HE染色、甲苯胺藍(lán)染色和Masson's三色染色組織學(xué)觀察，了解同種異體兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞/小腸黏膜下層復(fù)合物對(duì)兔耳廓缺損組織修復(fù)的情況。 五．同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與絲素蛋白（SF）/殼聚糖（CS）大孔微載體復(fù)合物修復(fù)兔耳廓缺損方法將SF和CS按照一

7、定比例混合，通過乳化-化學(xué)交聯(lián)、冷凍干燥、極性溶液處理制成具有多孔結(jié)構(gòu)的SF/CS大孔微載體；將同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與SF/CS大孔微載體體外復(fù)合培養(yǎng)，倒置顯微鏡每日觀察微載體材料上細(xì)胞生長情況，7d后植入兔耳廓缺損區(qū)，分別于8、12周取材行大體觀察和HE染色、Masson's三色染色組織學(xué)觀察。 結(jié)果： 一．貼壁培養(yǎng)法可分離并純化兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，所得第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)14d后細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)閳A形、

8、長菱形及三角形等不規(guī)則形狀、Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色陽性的軟骨細(xì)胞。 二．BrdU標(biāo)記后的兔骨髓間質(zhì)干細(xì)胞活細(xì)胞率在各時(shí)間段無顯著性差異（P>0．05），說明BrdU標(biāo)記時(shí)間的長短，對(duì)細(xì)胞的活性基本沒有影響；兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與兔軟骨細(xì)胞非接觸式分層培養(yǎng)誘導(dǎo)14d后，細(xì)胞胞漿被堿性磷酸酶染色染成典型的藍(lán)紫色，細(xì)胞核被雙染的DAB染色染成黃色，即Ⅱ型膠原免疫染色陽性的軟骨細(xì)胞。 三．在體外培養(yǎng)環(huán)境下，臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在一

9、定時(shí)間內(nèi)分化生長迅速，傳代后7～13 d細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期；16～19 d進(jìn)入平臺(tái)期，擴(kuò)增速度快于原代培養(yǎng)，倍增時(shí)間為8．5 d；細(xì)胞周期細(xì)胞計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用單因素重復(fù)測量方法分析顯示細(xì)胞生長周期各組間存在顯著差異（P<0．05），說明細(xì)胞增殖旺盛；Brdu標(biāo)記的人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)兔軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后分化形成的細(xì)胞，同正常兔軟骨細(xì)胞一樣，經(jīng)堿性磷酸酶染色和抗Brdu抗體染色雙染，細(xì)胞胞質(zhì)被染成藍(lán)紫色，細(xì)胞核表現(xiàn)為黃色，說明已被誘導(dǎo)后分化

10、為軟骨細(xì)胞。 四，同種異體兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后形成的軟骨細(xì)胞/小腸黏膜下層復(fù)合物植入體內(nèi)后，第4周時(shí)鏡下顯示復(fù)合物周圍有纖維組織形成包膜，新生組織內(nèi)炎性細(xì)胞數(shù)量較多；隨著時(shí)間延長，炎性細(xì)胞逐漸減少，軟骨細(xì)胞數(shù)目和軟骨基質(zhì)成分逐漸增加；第10周時(shí)軟骨陷窩明顯，細(xì)胞基質(zhì)增多，較第4周時(shí)軟骨細(xì)胞增多；16周時(shí)植入?yún)^(qū)有軟骨形成，小腸黏膜下層組織材料被完全吸收，經(jīng)蘇木精-伊紅染色，Massan染色，甲苯胺蘭染色檢查證實(shí)為

11、軟骨組織，但修復(fù)層軟骨較薄。 五．SF/CS大孔微載體表面呈多孔的海綿狀球形結(jié)構(gòu)，孔徑為40-80μm；體外培養(yǎng)環(huán)境下，兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠黏附在微載體的孔壁上生長、繁殖，形成集落性細(xì)胞團(tuán)；接種同種異體兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的SF/CS大孔微載體復(fù)合物經(jīng)體外培養(yǎng)7～10d后，植入兔耳廓缺損區(qū)，術(shù)后8周時(shí)鏡下顯示缺損區(qū)植入的復(fù)合物中有基質(zhì)分泌旺盛、胞體較小的新生軟骨細(xì)胞；術(shù)后12周時(shí)缺損區(qū)由新生軟骨組織填充，新生軟骨細(xì)胞接近成熟，但

12、新生軟骨組織較薄，部分區(qū)域填充不均勻。 結(jié)論： 一．在含有TGF-β1和轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、丙酮酸鈉等成分的特殊軟骨誘導(dǎo)體系培養(yǎng)條件下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化為免疫組化染色顯示與正常人鼻中隔軟骨細(xì)胞無明顯差別的軟骨細(xì)胞。 二．采用BrdU標(biāo)記細(xì)胞的方式證明軟骨細(xì)胞在體外可定向誘導(dǎo)分化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨細(xì)胞；BrdU對(duì)標(biāo)記細(xì)胞無毒副作用，對(duì)細(xì)胞增殖分化無影響，為組織工程化軟骨的構(gòu)建提供一種簡單易行的標(biāo)記方法。

13、 三．采用BrdU標(biāo)記的人臍血干細(xì)胞經(jīng)過兔軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)以后可以分化成軟骨細(xì)胞，這種方式為軟骨缺損的組織工程修復(fù)提供了又一種軟骨細(xì)胞來源。 四．經(jīng)過處理的同種異體小腸黏膜下層與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后生成的軟骨細(xì)胞在體外共培養(yǎng)生長，細(xì)胞生長良好，細(xì)胞相容性好；誘導(dǎo)后生成的同種異體軟骨細(xì)胞/小腸黏膜下層復(fù)合物在動(dòng)物體內(nèi)能夠形成新生軟骨組織，并成功修復(fù)軟骨缺損。 五．在體外，絲素蛋白/殼聚糖大孔微載體可與骨髓

14、間充質(zhì)干細(xì)胞共同生長，且細(xì)胞相容性良好；絲素蛋白/殼聚糖大孔微載體與同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞所形成的復(fù)合物植入有免疫力動(dòng)物體內(nèi)軟骨缺損區(qū)可形成軟骨組織并修復(fù)軟骨缺損。 意義： 一．本研究建立了含有TGF-β1和轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、丙酮酸鈉等成分的特殊軟骨誘導(dǎo)體系，并采用此體系將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞。 二．本研究首先采用Brdu標(biāo)記細(xì)胞的方式證明軟骨細(xì)胞在體外可定向誘導(dǎo)分化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為軟骨細(xì)胞的科學(xué)性

15、、可行性；Brdu標(biāo)記做為一種簡單的標(biāo)記方法可以更廣泛地應(yīng)用于組織工程明確細(xì)胞性質(zhì)的研究中。 三．采用Brdu標(biāo)記的人臍血干細(xì)胞經(jīng)過軟骨誘導(dǎo)以后可以分化成軟骨細(xì)胞，這種方法為軟骨缺損的組織工程修復(fù)、重建提供了又一軟骨細(xì)胞來源，尚未見報(bào)導(dǎo)。 四．本研究證明經(jīng)過處理的同種異體小腸黏膜下層與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后生成的軟骨細(xì)胞在體外共培養(yǎng)生長，細(xì)胞生長良好，細(xì)胞相容性好；軟骨細(xì)胞/小腸黏膜下層復(fù)合物在動(dòng)物體內(nèi)能夠