模擬微重力培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)復(fù)合支架修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、創(chuàng)傷和各種疾病引起的關(guān)節(jié)軟骨缺損對患者生活質(zhì)量影響很大。因此多年來，骨科醫(yī)生致力于探索和完善修復(fù)和重建符合關(guān)節(jié)軟骨解剖和功能的方法。曾用自體或同種異體軟骨及人工替代材料應(yīng)用于臨床，但因材料來源、供區(qū)缺損、免疫排斥等方面存在不足，組織工程技術(shù)的發(fā)展有可能避免傳統(tǒng)治療方法的缺陷，解決修復(fù)與重建軟骨缺損之一難題。組織工程技術(shù)需要大量的種子細(xì)胞和良好的細(xì)胞支架材料，才能滿足工程化組織或器官的生成和塑形要求。種子細(xì)胞的培養(yǎng)是組織工程的基本要素，細(xì)

2、胞主要來源于自體、同種異體、異種組織細(xì)胞等。自體組織細(xì)胞應(yīng)列為首選。由于軟骨組織工程多需要高濃度的細(xì)胞接種，自體軟骨細(xì)胞存在著數(shù)量上的局限性及長期傳代后細(xì)胞功能老化的問題。干細(xì)胞工程是利用現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)和組織工程技術(shù)，通過對干細(xì)胞進(jìn)行體外分離純?nèi)A、定向誘導(dǎo)分化、大量擴(kuò)增和整合構(gòu)建，在體外重建組織和器官。干細(xì)胞是指那些具有自我復(fù)制能力，并且可以通過不可逆的終末分化過程產(chǎn)生子代細(xì)胞的細(xì)胞，產(chǎn)生多種組織細(xì)胞的表達(dá)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是目前的干細(xì)胞

3、研究中的一個(gè)熱點(diǎn)，它具有分化成多種中胚層組織，包括骨與軟骨組織、肌腱、肌肉、脂肪、神經(jīng)、皮膚組織以及骨髓基質(zhì)組織。組織培養(yǎng)中環(huán)境控制是其中的難點(diǎn)，力學(xué)因素是組織工程中的重要影響因素之一，近年來的研究表明，力學(xué)作用可以刺激細(xì)胞因子及激素的分泌，改變?nèi)S支架上培養(yǎng)的種子細(xì)胞的新陳代謝，從而促進(jìn)組織的生長與重建。依照仿生學(xué)的觀點(diǎn)，用于關(guān)節(jié)軟骨組織工程的力學(xué)環(huán)境需要三個(gè)條件：1，對接種在三維支架上的細(xì)胞提供足夠的力學(xué)刺激；2，保證細(xì)胞營養(yǎng)和排泄

4、物的有效物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)；3，促進(jìn)功能性細(xì)胞外基質(zhì)在三維支架中的分泌合成。隨著太空航天技術(shù)的發(fā)展，微重力組織工程技術(shù)的誕生，為建立三維細(xì)胞培養(yǎng)體系開創(chuàng)了新時(shí)代，轉(zhuǎn)壁式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)模擬了微重力培養(yǎng)環(huán)境，降低了培養(yǎng)液對細(xì)胞產(chǎn)生的機(jī)械剪切力，保證了細(xì)胞營養(yǎng)和排泄物的轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)了在其中的細(xì)胞表現(xiàn)出三維增殖與細(xì)胞分化，滿足了細(xì)胞在可吸收聚合物中的營養(yǎng)需要，減少處于中心部位的細(xì)胞由于營養(yǎng)不良或代謝不暢而導(dǎo)致的生長遲滯甚至死亡，使細(xì)胞周圍更接近在體內(nèi)生理環(huán)境

5、。 研究目的: 將兔BMSCs定向誘導(dǎo)為軟骨細(xì)胞，復(fù)合經(jīng)過抑肽酶和氨甲環(huán)酸改良的纖維蛋白膠（FG）細(xì)胞支架，構(gòu)成軟骨細(xì)胞一支架復(fù)合物，然后利用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀進(jìn)行軟骨細(xì)胞-支架復(fù)合物模擬微重力培養(yǎng)，觀察復(fù)合材料內(nèi)軟骨細(xì)胞在動物體外的生長情況、改良支架材料的降解特性，以及組織工程軟骨細(xì)胞外基質(zhì)分泌的相關(guān)情況與其在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的相關(guān)情況，探索在模擬微重力環(huán)境下改良軟骨模塊修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的效用及其可能的臨床應(yīng)用價(jià)值。

6、 研究方法: 一、動物體外實(shí)驗(yàn)部分：1．取3周齡新西蘭幼兔的兔骨髓MSCs，體外分離培養(yǎng)，擴(kuò)增及誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞，將制取的軟骨細(xì)胞，體外單層培養(yǎng)、擴(kuò)增后種植于改良FG支架上，構(gòu)建細(xì)胞改良FG支架復(fù)合物。2．將復(fù)合物分成兩組：旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)組、和普通對照組。旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)組利用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀進(jìn)行模擬微重力培養(yǎng)，普通對照組在23孔板靜止培養(yǎng)，均在體外進(jìn)行2周的培養(yǎng)、擴(kuò)增。觀察軟骨細(xì)胞的形態(tài)變化，繪制細(xì)胞生長曲線，光鏡和透射電鏡下的形態(tài)學(xué)觀察

7、，了解模擬微重力對細(xì)胞改良FG支架復(fù)合物培養(yǎng)的影響。 二、動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分：將48只雙側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的3月齡新西蘭兔動物模型隨機(jī)分為4組。在A組、B組和C組的關(guān)節(jié)軟骨缺損中分別植入在模擬微重力環(huán)境下培養(yǎng)的細(xì)胞改良FG支架復(fù)合物、普通環(huán)境下培養(yǎng)的細(xì)胞改良FG支架復(fù)合物以及無細(xì)胞的單純改良FG支架，D組為空白對照組。術(shù)后第2、6、12周取材，進(jìn)行大體評測，組織形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)檢測，并觀察載體降解情況，于第12周標(biāo)本按照Wakira

8、ni標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織工程學(xué)評分，然后對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 研究結(jié)果: 1．倒置顯微鏡下的觀察結(jié)果：原代培養(yǎng)的BMSCs細(xì)胞48 h內(nèi)大部分貼壁，細(xì)胞呈形態(tài)較一致的短梭形、多邊形，3～5 d時(shí)可見明顯集落形成，增殖速度快，7-8天左右細(xì)胞互相融合，細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣，排列呈螺旋狀、魚群狀或漩渦狀。傳代培養(yǎng)的BMSCs貼壁很快（12h內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞已貼壁），呈長梭形，形態(tài)更加均勻，生長旺盛，3-4d左右即可達(dá)到90%融合，7

9、d左右生長逐漸緩慢。兩組復(fù)合物的細(xì)胞生長曲線有顯著差別。 2．大體標(biāo)本及組織學(xué)觀察：術(shù)后第2周，各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)可見種植的模塊，邊界清楚，與周圍組織未融合，無一例種植塊脫落?？瞻捉M內(nèi)只見少許淤血塊。術(shù)后6周，微重力培養(yǎng)系統(tǒng)組實(shí)驗(yàn)側(cè)可見不典型的透明軟骨組織，軟骨細(xì)胞位于陷窩中，細(xì)胞數(shù)量較多，排列較為規(guī)則，可見分區(qū)，甲胺藍(lán)染色陽性基質(zhì)含量較高，局部可見少許淋巴細(xì)胞浸潤，關(guān)節(jié)軟骨缺損部修復(fù)面約為正常軟骨的3/5～3/4，表面較為平整；普通培

10、養(yǎng)細(xì)胞支架組側(cè)亦可見不典型透明軟骨組織，軟骨細(xì)胞位于陷窩中，細(xì)胞數(shù)量較多，排列不規(guī)則，甲胺藍(lán)染色陽性基質(zhì)較前組為少，修復(fù)面平整，修復(fù)組織厚度大約為鄰近軟骨的1/3～3/5；單純支架側(cè)為纖維組織覆蓋，表面凹凸不平，凹陷明顯，周圍邊界清楚，在單純支架組偶有類纖維軟骨形成，并有吞噬降解材料的巨噬細(xì)胞出現(xiàn)，而在完全空白組表面可見一薄層組織敷蓋，主要為一纖維疤痕及炎性組織敷蓋。術(shù)后12周，微重力培養(yǎng)系統(tǒng)組實(shí)驗(yàn)側(cè)修復(fù)軟骨與鄰近軟骨整合緊密、厚度相近

11、、細(xì)胞位于軟骨陷窩中，數(shù)量較正常軟骨為多，富含甲苯胺藍(lán)染色陽性基質(zhì)，修復(fù)軟骨結(jié)構(gòu)與正常軟骨相似，表層細(xì)胞呈橢圓形，長軸與關(guān)節(jié)面平行，中間細(xì)胞呈圓形，放射區(qū)內(nèi)細(xì)胞有柱狀排列趨勢；普通培養(yǎng)支架組側(cè)亦可見部分透明軟骨組織，軟骨細(xì)胞位于陷窩中，細(xì)胞數(shù)量尚可，排列欠規(guī)則，甲胺藍(lán)染色陽性基質(zhì)較前增多，修復(fù)面較為平整，部分修復(fù)組織厚度大約為鄰近軟骨3/5，2例標(biāo)本修復(fù)表面可見少許凹陷，單純支架組為纖維組織覆蓋，表面凹凸不平，凹陷明顯，周圍邊界清楚，在

12、單純支架組偶有類纖維軟骨形成，并有吞噬降材料的巨噬細(xì)胞出現(xiàn)；空白組內(nèi)為——松散的纖維疤痕組織敷蓋及部分炎性細(xì)胞的存在。軟骨缺損修復(fù)的組織工程學(xué)評分：第12周標(biāo)本按照Wakitani評分法對于各期關(guān)節(jié)軟骨缺損動物模型體內(nèi)組織工程軟骨塊植入后的修復(fù)進(jìn)行評分，進(jìn)行組織工程學(xué)軟骨修復(fù)評分。 結(jié)論: 1．兔BMSCs定向誘導(dǎo)為軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞適用于組織工程修復(fù)軟骨的缺損。 2．在體外環(huán)境下，模擬微重力組的細(xì)胞生長繁殖周