BF2-肽四聚體的構(gòu)建及其在傳染性支氣管炎病毒特異性T細(xì)胞反應(yīng)評價中的應(yīng)用.pdf

1、1996年建立的MHIC l類分子/肽四聚體技術(shù)，是一種檢測特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicT lymphocytes.CTLs)的方法。該方法已在人類及模擬動物的相關(guān)領(lǐng)域得到較為廣泛的研究和應(yīng)用,然而在獸醫(yī)學(xué)相關(guān)研究中，只有近年來在豬和馬上有了初步的研究。目前，該項(xiàng)技術(shù)在禽類的研究尚屬空白. 為了構(gòu)建雞的MHC/肽四聚體,本實(shí)驗(yàn)從SPF萊航雞全血克隆了雞MHC l重鏈α(BF2)和β2微球蛋白(Chβ2m)全基因,

2、經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化分析表明本實(shí)驗(yàn)所獲得的BF2基因?yàn)锽15單倍型.然后利用軟件分析了其各自的信號肽序列及BF2的跨膜區(qū),利用引物分別缺失了這兩段基因的信號肽序列以及BF2的跨膜區(qū),并在BF2基因的3'端融合了BirA底物肽(BSP)序列.將經(jīng)改造的兩段基因分別克隆至融合蛋白重組表達(dá)載體中,分別命名為pET-BF<,2>-BSP和pET-Chβ2m,并將其分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),獲得了包涵體表達(dá)的重組蛋白,表達(dá)產(chǎn)

3、物溶解于8M脲中,經(jīng)SDS-PAGE分析,結(jié)果表明所得融合目的蛋白分別約為38kD和15kD,Western-blot。結(jié)果顯示，該重組蛋白均成功地融合了6xHis標(biāo)簽.為了獲得大量的目的蛋白,優(yōu)化了誘導(dǎo)劑濃度、起始誘導(dǎo)菌體濃度及誘導(dǎo)時間等表達(dá)條件.此外,建立了重組蛋白BF2-BSP和Chβ2m在變性狀態(tài)下通過鎳柱親和層析純化包涵體的方法,獲得了高純度的重組蛋白BF2-BSP和Chβ32m. 根據(jù)文獻(xiàn)所報(bào)道,合成了雞傳染性支氣管

4、炎病毒(IBV)核蛋白N<,71-78>T細(xì)胞表位肽,將其與純化后的重組蛋白BF2-BSP和Chβ2m在重折疊緩沖液中復(fù)性.復(fù)性后在快速蛋白液相色譜儀(FPLC)上分離出復(fù)性組裝成功的.BF2/肽單體復(fù)合物.將該單體復(fù)合物在體外進(jìn)行生物素化,其產(chǎn)物再次采用FPLC通過分子篩分離出生物素化后的BF2/肽單體復(fù)合物:通過鏈霉親和素遷移實(shí)驗(yàn)檢測體外生物素化效率,然后將生物素化后的BF2/肽單體復(fù)合物與藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的鏈霉親和素按一定比例

5、反應(yīng)生成BF2/肽四聚體. 為了檢測所制備BF2/肽四聚體的功能,采用10<'5.5>EID<,50>的lBVH52株接種一周齡SPF雞,10d后采抗凝血用淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC,調(diào)整細(xì)胞濃度后取1×10<'6>個細(xì)胞進(jìn)行抗雞CD8單抗和BF2/肽四聚體雙色熒光染色,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測并分析染色結(jié)果,結(jié)果表明所制備的BF2/肽四聚體可用丁檢測lBv N蛋白特異性T淋巴細(xì)胞,檢測一周齡SPF雞接種H52后10d時針對N蛋白的特

6、異性T細(xì)胞比率為3.65﹪. 為了探討SPF雞在感染IBV后體內(nèi)抗體水平及針對N 蛋白特異性的T淋巴細(xì)胞的動態(tài)變化,將125羽SPF雞隨機(jī)分為二組分別作為接種免疫組、攻毒對照組和空白對照組.采川IBVH52標(biāo)準(zhǔn)毒株對其通過滴鼻方式進(jìn)行免疫,之后每3天剖殺5羽觀察各臟器的病理學(xué)變化、檢測血清抗體效價并采用BF2/肽四聚體評價其N蛋白特異性T細(xì)胞的比例:免疫15d時采用IBV M41對免疫組和攻毒對照組進(jìn)行攻毒,同樣檢測上述指標(biāo).最