RNA病毒感染組織標(biāo)本保存方法探討.pdf

1、目的:探討固定劑、固定時間及溫度對RNA病毒感染組織總RNA的完整性、得率及病毒RNA擴(kuò)增的影響.以及固定劑和固定時間對石蠟包埋組織中RNA降解和標(biāo)本病理形態(tài)學(xué)的影響.方法:取漢坦病毒76-118株接種乳鼠的感染組織,以沉淀脫水類固定劑100﹪甲醇、75﹪乙醇、100﹪丙酮以及醛類固定劑4﹪的多聚甲醛磷酸緩沖液(4﹪PFA)、10﹪福爾馬林共五種固定劑,分別在4℃和室溫下固定病毒感染組織6h、12h、24h和48h后,對固定后標(biāo)本進(jìn)行如

2、下檢測或處理:1、從固定6h~48h后的標(biāo)本中直接提取組織總RNA,用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性;以分光光度計測吸光度計算組織總RNA得率;用巢式RT-PCR擴(kuò)增病毒RNA序列,電泳檢測PCR產(chǎn)物并行灰度掃描.對RNA得率及PCR產(chǎn)物電泳所測灰度值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析.2、將固定后的病毒感染組織標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋長期保存.對石蠟包埋組織切片后HE染色,鏡下觀察各種固定劑對組織病理形態(tài)學(xué)的影響.從長期保存的各種方式固定后石蠟包埋組織中以RT-

3、PCR擴(kuò)增出不同片段長度的病毒RNA及β-actin RNA序列,以獲得產(chǎn)物最大長度或?qū)﹂L片段擴(kuò)增的可重復(fù)性及假陰性的多少,來反映各種固定方式對病毒RNA和細(xì)胞總RNA降解的影響.結(jié)論:1、固定劑類型、固定溫度及固定持續(xù)時間的不同對病毒感染組織標(biāo)本的保存產(chǎn)生明顯的影響.2、甲醇、75﹪乙醇及丙酮三種沉淀脫水類固定劑固定感染組織后雖產(chǎn)生一定的收縮效應(yīng),但不影響鏡下形態(tài)學(xué)的觀察.對核酸完整性的保存明顯優(yōu)于醛類固定劑.與醛類固定劑相比,沉淀類