哮喘氣道杯狀細(xì)胞特有hCLCA1的體外表達(dá)及自裂解分泌型形式的鑒定.pdf

1、【研究背景】
　　哮喘的臨床特征表現(xiàn)為氣道高反應(yīng)性和氣道黏液高分泌,慢性非特異性氣道炎癥是哮喘重要的發(fā)病機(jī)制。黏液高分泌是哮喘患者肺功能下降,以及致死性哮喘發(fā)生的因素之一,但目前臨床尚缺乏抑制黏液高分泌的手段。氣道上皮杯狀細(xì)胞數(shù)量增多是黏液高分泌的病理基礎(chǔ),探討杯狀細(xì)胞的病變機(jī)制是控制該臨床癥狀的突破口。已有的研究證實(shí),人鈣激活氯離子通道I型(human calcium-activated chloride channel1,hC

2、LCA1)作為新生杯狀細(xì)胞的特異性表達(dá)蛋白,通過調(diào)控黏蛋白5AC(Mucin5AC,MUC5AC)的合成,在氣道黏液合成及分泌過程中扮演了重要角色。hCLCA1和小鼠鈣激活氯離子通道III型Murine calcium-activated chloride channel type3,mCLCA3)是異種同源蛋白,分別在各自的物種氣道黏液高分泌中起著關(guān)鍵作用。早期人們認(rèn)為它們是一種跨膜通道離子蛋白,但近年國外的研究小組發(fā)現(xiàn),mCLCA3

3、和hCLCA1是分泌型蛋白,可以自裂解為N端的75 kD和C端的35 kD的兩個(gè)獨(dú)立結(jié)構(gòu),可能N端能作為獨(dú)立的個(gè)體行使全長的功能,通過對(duì)膜氯離子通道蛋白的調(diào)控作用,來實(shí)現(xiàn)對(duì)黏液蛋白合成與分泌的調(diào)節(jié)。同時(shí),鈣激活氯離子通道(Calcium-activated chloride channel,CLCA)與氣道炎癥的形成也存在密切的關(guān)系,甚至可能互為因果。體外表達(dá)和純化 hCLCA1是進(jìn)一步研究該蛋白功能的基礎(chǔ)和前提,同時(shí),進(jìn)一步驗(yàn)證hCL

4、CA1的存在形式有利于揭示該蛋白的作用機(jī)制。
　　【目的】
　　觀察 hCLCA1在離體的上皮細(xì)胞模型 NCI-H292細(xì)胞中的表達(dá)及分泌情況,探討 hCLCA1作為氣道炎癥介質(zhì)的可能性。本課題組前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)mCLCA3對(duì)小鼠哮喘模型的炎癥及黏液分泌具有促進(jìn)作用,mCLCA3的抗體可以阻斷哮喘小鼠模型的炎癥進(jìn)程,對(duì)炎癥的發(fā)展有一定的阻斷作用。本實(shí)驗(yàn)對(duì) mCLCA3的異種同源蛋白hCLCA1的N端的蛋白在大腸桿菌內(nèi)誘

5、導(dǎo)表達(dá),并進(jìn)行了其N端功能結(jié)構(gòu)區(qū)蛋白純化及鑒定,為進(jìn)行下一步的蛋白功能研究做準(zhǔn)備。通過將 hCLCA1過表達(dá)慢病毒感染NCI-H292后,收集上清及細(xì)胞沉淀,進(jìn)行western blotting驗(yàn)證,觀察hCLCA1在離體人上皮細(xì)胞中的合成及自裂解,為hCLCA1在人氣道黏液高分泌癥狀中扮演的角色進(jìn)行初步研究。
　　【方法與結(jié)果】
　　1.成功構(gòu)建hCLCA1全長的真核及N端的原核質(zhì)粒。⑴將N端約2200 bp目的片段插入p

6、ET28a載體,用SalI及Xhol1對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,得到大小為2200 bp的片段,與預(yù)期結(jié)果相符。測(cè)序表明重組質(zhì)粒pET28a(+)/hCLCA1-N構(gòu)建成功。⑵將hCLCA1全長基因約2935 bp目的片段插入pEGFP-N1載體,用SalI及BglII對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,得到大小為2935 bp的片段,與預(yù)期結(jié)果相符。測(cè)序重組質(zhì)粒EGFP-N1(+)/hCLCA1構(gòu)建成功,可以進(jìn)行下一步的轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。⑶利用轉(zhuǎn)染試劑Tube

7、rfect在HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染EGFP-N1(+)/hCLCA1重組質(zhì)粒,細(xì)胞轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間觀察綠色熒光蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示hCLCA1可以在NCI-H293細(xì)胞中成功表達(dá)。24 h后取出細(xì)胞爬片,利用DAPI進(jìn)行核染色觀察細(xì)胞定位。結(jié)果顯示GPF-hCLCA1在細(xì)胞核周圍的細(xì)胞器中表達(dá)量較高。
　　2.hCLCA1-N蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定。⑴誘導(dǎo)pET28a(+)/hCLCA1-N轉(zhuǎn)化的BL21菌株,經(jīng)篩選獲得最佳表達(dá)時(shí)

8、間(5 h)、溫度(30℃)、濃度(0.5 mmoL/L)。⑵以最佳條件進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá),在冰上進(jìn)行充分的超聲裂解,分別對(duì)收集到的上清、沉淀樣品進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)表明,我們的目的蛋白大多數(shù)存在沉淀樣品中,約占80％。⑶對(duì)蛋白進(jìn)行His鎳柱純化,SDS-PAGE電泳顯示獲得純度較高的目的蛋白,Western blotting在70 kD分子量大小附近有一條明顯條帶;而在未誘導(dǎo)細(xì)菌總蛋白中無該條帶。結(jié)果顯示,所純化的Hish-hCLCA

9、1-N融合蛋白正確,為下一步實(shí)驗(yàn)的hCLCA1的單克隆抗體制備及后續(xù)的抗體干預(yù)細(xì)胞功能提供了條件。
　　3.對(duì)hCLCA1進(jìn)行了慢病毒載體的包裝并感染NCI-H292細(xì)胞。⑴將慢病毒包裝輔助質(zhì)粒與穿梭質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)染試劑Turbofect轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,免疫熒光結(jié)果顯示48h后 HEK293細(xì)胞的表達(dá)情況良好,轉(zhuǎn)染效率較高。⑵收集病毒上清,感染NCI-H292細(xì)胞48h后,收集細(xì)胞及上清做Western Blotting檢測(cè),結(jié)果

10、顯示在細(xì)胞上清中可以檢測(cè)到60 KD的蛋白,在細(xì)胞中檢測(cè)到60 KD及130 KD左右的蛋白,去除EGFP片段大小后說明hCLCA1蛋白可以在NCI-H292細(xì)胞內(nèi)自裂解為N端和C端兩個(gè)獨(dú)立結(jié)構(gòu)。這為后期將分泌的上清蛋白進(jìn)行上皮細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的趨化及黏附功能的研究打下基礎(chǔ)。
　　【結(jié)論】
　　1.本實(shí)驗(yàn)合成了人的hCLCA1-N段胞外活性肽段,進(jìn)行了蛋白的原核表達(dá)和純化,為后期針對(duì)人hCLCA1的抗原合成打下了基礎(chǔ)。