鈣激活氯離子通道對哮喘氣道杯狀細(xì)胞凋亡與黏液高分泌的影響.pdf

1、支氣管哮喘(哮喘)是一種常見的氣道慢性炎癥性疾病,以氣道高反應(yīng)性和氣道黏液高分泌為主要病理生理特征,發(fā)病率較高且花費(fèi)巨大。哮喘中黏液高分泌阻塞氣道導(dǎo)致氣流受限,是第1秒用力呼氣量(FEV1)下降加速的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,成為重癥哮喘的主要死因。但目前針對消除黏液高分泌尚無有效的控制手段,臨床亟需新的治療策略。氣道杯狀細(xì)胞增生是導(dǎo)致黏液高分泌的重要病理基礎(chǔ)。在哮喘患者研究中證實(shí)氣道杯狀細(xì)胞凋亡減少,特異性高表達(dá)人鈣激活氯離子通道I型(humen

2、calcium-activatedchloridechannel1,hCLCA1),與氣道杯狀細(xì)胞增生、黏液高分泌密切相關(guān);在進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),哮喘小鼠模型中同源異種鈣激活氯離子通道III型(murinecalcium-activatedchloridechanneltype3,mCLCA3)表達(dá)與氣道杯狀細(xì)胞增生、黏液高分泌密切相關(guān),且可通過凋亡途徑減少增多的杯狀細(xì)胞以恢復(fù)原有平衡。故杯狀細(xì)胞中CLCA表達(dá)與凋亡均是調(diào)控哮喘黏液高分泌

3、的有效靶點(diǎn),二者之間可能存在一定關(guān)聯(lián),通過特異性阻斷CLCA,改變氣道杯狀細(xì)胞內(nèi)外生理特性,可能會(huì)對杯狀細(xì)胞凋亡及黏液分泌產(chǎn)生一定作用,達(dá)到治療黏液高分泌目的。
　　目的:
　　觀察哮喘小鼠和哮喘患者氣道杯狀細(xì)胞mCLCA3和hCLCA1的表達(dá)及凋亡情況,并分析二者之間及其與氣道黏液高分泌的關(guān)系;經(jīng)鼻氣道內(nèi)滴入mCLCA3單克隆抗體,觀察其對哮喘小鼠氣道杯狀細(xì)胞凋亡及氣道黏液分泌的影響,為以CLCA為靶點(diǎn)誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞凋亡的哮

4、喘黏液高分泌的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.支氣管鏡活檢收集10例哮喘患者和10例正常人氣道上皮組織標(biāo)本,通過HE染色、PAS染色、免疫組化、TUNEL和RT-PCR等方法比較兩組氣道杯狀細(xì)胞數(shù)量、凋亡和凋亡蛋白分布及氣道組織MUC5AC和hCLCA1mRNA表達(dá)水平。
　　2.80只BALB/c小鼠以腹腔注射卵白蛋白致敏,隨后按激發(fā)天數(shù)隨機(jī)分為16組:A~P組,通過HE染色、PAS染色、免疫組化、TUNEL

5、、RT-PCR和ELISA等方法比較不同激發(fā)天數(shù)組小鼠肺組織mCLCA3和MUC5ACmRNA表達(dá)、mCLCA3和凋亡相關(guān)蛋白分布、氣道杯狀細(xì)胞數(shù)量與凋亡、BALF中MUC5AC含量變化。
　　3.30只BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組:對照小鼠組,哮喘小鼠組,mCLCA3抗體干預(yù)組。后兩組建立哮喘模型,干預(yù)組經(jīng)鼻給予mCLCA3單克隆抗體干預(yù)。通過HE染色、PAS染色、免疫組化、TUNEL和ELISA等方法評估各組小鼠氣道黏液分泌、

6、氣道杯狀細(xì)胞數(shù)量與凋亡等情況。
　　結(jié)果:
　　1.哮喘患者氣道杯狀細(xì)胞比例和Bcl-2+杯狀細(xì)胞比例分別為0.456±0.072和0.372±0.068,明顯高于健康對照組(分別為0.230±0.051,0.233±0.044,P均<0.05),其Bax+杯狀細(xì)胞比例和凋亡杯狀細(xì)胞比例分別為0.152±0.033和0.022±0.009則明顯低于對照組(分別為0.606±0.081,0.076±0.015,P均<0.05)

7、;哮喘患者氣道組織高表達(dá)hCLCA1mRNA(0.219±0.043),而對照組幾乎無表達(dá);哮喘患者氣道組織MUC5ACmRNA表達(dá)(0.603±0.150)高于對照組(0.190±0.095,P<0.05);哮喘組中氣道組織hCLCA1mRNA表達(dá)水平與杯狀細(xì)胞比例呈正相關(guān)(r=0.67,P<0.05),與MUC5ACmRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.71,P<0.05);兩組中凋亡杯狀細(xì)胞比例Bax+杯狀細(xì)胞比例呈正相關(guān)(r=0.6

8、2,P<0.05),與Bcl-2+杯狀細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)(r=-0.59,P<0.05),與氣道杯狀細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)(r=-0.477,P<0.05)。
　　2.小鼠氣道杯狀細(xì)胞比例隨激發(fā)時(shí)間逐漸增加,第7天(H組)達(dá)最多,可維持到第10天(K組),隨后逐漸減少。H組、K組、P組(激發(fā)15天)氣道杯狀細(xì)胞比例分別為0.910±0.140,0.896±0.091,0.460±0.150,明顯多于無激發(fā)A組(0.0700±0.035,P

9、均<0.05);H組氣道杯狀細(xì)胞mCLCA3蛋白表達(dá)較高,而A組幾乎無表達(dá);H組、K組、P組Bax+氣道杯狀細(xì)胞比例分別為0.201±0.055、0.358±0.103和0.443±0.192,明顯高于A組(0.103±0.021,P均<0.05);H組、K組、P組Bcl-2+氣道杯狀細(xì)胞比例分別為0.252±0.044、0.204±0.090和0.096±0.041,明顯低于A組(0.301±0.082,P均<0.05);H組、K組、

10、P組氣道上皮細(xì)胞凋亡比例分別為0.107±0.033、0.175±0.048和0.251±0.103,明顯高于A組(0.024±0.009,P均<0.05);H、K、P組小鼠氣道組織中mCLCA3mRNA水平與MUC5ACmRNA水平呈正相關(guān)(r=0.81,P<0.05);各組小鼠氣道杯狀細(xì)胞Bax+比例與凋亡比例呈正相關(guān)(r=0.73,P<0.05);各組小鼠氣道杯狀細(xì)胞Bcl-2+比例與凋亡比例呈負(fù)相關(guān)(r=-0.51,P<0.05

11、);各組小鼠BALF中MUC5AC含量與氣道杯狀細(xì)胞凋亡比例呈負(fù)相關(guān)(r=-0.69,P<0.05)。
　　3.單抗治療組氣道杯狀細(xì)胞比例為0.665±0.067,明顯低于哮喘組(0.896±0.091,P<0.05),氣道杯狀細(xì)胞凋亡比例為0.310±0.059,明顯高于哮喘組(0.177±0.050,P<0.05),Bax+氣道杯狀細(xì)胞比例為0.411±0.095,明顯高于哮喘組(0.252±0.062,P<0.05),Bcl

12、-2+氣道杯狀細(xì)胞比例為0.145±0.044,明顯低于哮喘組(0.220,±0.032);氣道BALF中MUC5AC含量為5.9±1.9ng/mL,明顯低于哮喘組(14.7±4.8ng/mL,P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.哮喘患者氣道上皮組織特異性高表達(dá)hCLCA1,杯狀細(xì)胞凋亡減少,與杯狀細(xì)胞增生及黏液高分泌密切相關(guān)。
　　2.哮喘小鼠氣道杯狀細(xì)胞特異性表達(dá)mCLCA3,與杯狀細(xì)胞增生及黏液高分泌密切相關(guān);