LXR激動(dòng)劑抑制高脂飼養(yǎng)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變形成及其機(jī)制研究.pdf

1、【目的】肝孤兒受體(liver X receptors, LXR)已被證實(shí)是體內(nèi)膽固醇平衡的重要調(diào)控因子.LXR通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞膽固醇外流、肝臟膽汁酸合成、腸道膽固醇吸收等膽固醇代謝關(guān)鍵過(guò)程直接作用于膽固醇的分解、存儲(chǔ)、吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程,成為機(jī)體膽固醇平衡的感受器.ABCA1(ATP binding cassette A1,ABCA1) 是控制巨噬細(xì)胞中膽固醇外流的關(guān)鍵蛋白,最近幾項(xiàng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),LXR配體/激動(dòng)劑能抑制小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變

2、的形成,但具體機(jī)制尚未明確,目前認(rèn)為主要是通過(guò)促進(jìn)ABCA1等膽固醇外流調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá),加強(qiáng)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn),維持機(jī)體膽固醇平衡實(shí)現(xiàn)的,并且可能存在著除改善巨噬細(xì)胞和肝腸細(xì)胞脂質(zhì)代謝以外的其它有益作用.LXR蛋白主要分布在細(xì)胞核中,為配體依賴性核受體,與相應(yīng)的配體/激動(dòng)劑結(jié)合后才能被活化,然后需與維甲酸X受體(retinoid X receptors, RXR)結(jié)合形成LXR/RXR異源二聚體,通過(guò)與靶基因的LXR反應(yīng)元件(LXR resp

3、onse elements ,LXRE)結(jié)合,調(diào)節(jié)靶基因表達(dá),發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng).LXR的配體即LXR激動(dòng)劑,包括天然氧化甾醇、化學(xué)合成的氧化甾醇及其類似物.目前,國(guó)外已通過(guò)化學(xué)方法人工合成了一些LXR配體,如T-0901317、hypocholamide等,第三軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)教研室采用高立體選擇性化學(xué)合成法,以豬去氧膽酸為原料高效合成了LXR激動(dòng)劑3β-羥基-5α,6α環(huán)氧膽酸甲酯(methyl 3β-hydroxy-5α,6α-epox

4、ycholante,MHEC),該實(shí)驗(yàn)采用MHEC和T-0901317兩種LXR激動(dòng)劑為實(shí)驗(yàn)用藥,以高脂喂養(yǎng)的ApoE基因敲除小鼠為動(dòng)脈粥樣硬化模型,并以培養(yǎng)的單核/巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),研究了LXR激動(dòng)劑的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用及機(jī)制.【方法】應(yīng)用RT-PCR方法觀察MHEC和T-0901317兩種LXR激動(dòng)劑對(duì)人THP-1巨噬細(xì)胞ABCA1、LXRα,LXRβ基因表達(dá)的影響和MHEC對(duì)ECV-304血管內(nèi)皮細(xì)胞ABCA1、

5、LXRα基因表達(dá)的影響;應(yīng)用免疫組化S-P法檢測(cè)LXR激動(dòng)劑對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞和ECV-304血管內(nèi)皮細(xì)胞ABCA1蛋白表達(dá)的影響;應(yīng)用小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型觀測(cè) LXR激動(dòng)劑對(duì)血脂和動(dòng)脈粥樣硬化病變的整體影響,用免疫組化S-P法檢測(cè)小鼠動(dòng)脈粥樣病變組織中ABCA1、iNOS、eNOS、PCNA、PAI-1蛋白表達(dá)的變化.【結(jié)果】1.正常狀態(tài)THP-1巨噬細(xì)胞和ECV-304細(xì)胞中都有ABCA1、LXRα基因表達(dá), LXR激動(dòng)劑作用后,

6、兩種細(xì)胞中ABCA1、LXRα基因表達(dá)都呈時(shí)間和劑量依賴性的增加.兩種LXR激動(dòng)劑對(duì)巨噬細(xì)胞LXRβ基因表達(dá)的影響不同, T-0901317可上調(diào)THP-1細(xì)胞中LXRβ的表達(dá),MHEC在較高濃度時(shí)(10μmol/L)才能促進(jìn)LXRβ的表達(dá).兩種細(xì)胞中均有LXRα基因自身激活的級(jí)聯(lián)放大調(diào)控環(huán)路存在.2.MHEC和T-0901317都使小鼠血脂發(fā)生了明顯改變,但影響不同,T-0901317組ApoE-/-小鼠TC、TG升高,HDL-C也升

7、高( P<0.05); 而MHEC組沒(méi)有出現(xiàn)TG、TC升高,僅表現(xiàn)為HDL-C升高.高脂飼料喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠MHEC組與高脂對(duì)照組相比,TG明顯降低( P<0.05),而T-0901317組C57BL/6J小鼠各項(xiàng)血脂成分與對(duì)照組相比,沒(méi)有明顯變化.3.MHEC和T-0901317組ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變程度與對(duì)照組相比均有明顯降低,主動(dòng)脈內(nèi)膜動(dòng)病變面積百分比減少分別達(dá)到36.79﹪和34.23﹪,主動(dòng)脈根部橫切面

8、病變面積減少分別達(dá)到34.12﹪和35.65﹪.4.與對(duì)照組相比,兩種LXR激動(dòng)劑組ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣病變組織中ABCA1和eNOS表達(dá)均明顯增多,iNOS表達(dá)明顯減少,PCNA和PAI-1的表達(dá)無(wú)明顯變化.【結(jié)論】1.MHEC能明顯上調(diào)人THP-1巨噬細(xì)胞中ABCA1、LXRα基因表達(dá),其上調(diào)ABCA1程度與國(guó)外LXR激動(dòng)劑T-0901317相似.MHEC在較高濃度時(shí)也有一定的LXRβ上調(diào)作用,提示MHEC是一種有效的α選擇性

9、為主的LXR激動(dòng)劑.實(shí)驗(yàn)證實(shí)巨噬細(xì)胞中有LXRα基因自身激活的級(jí)聯(lián)放大調(diào)控環(huán)路存在并發(fā)現(xiàn)ECV304細(xì)胞中也存在這種機(jī)制.MHEC能明顯上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV-304中ABCA1、LXRα基因的表達(dá),提示LXR激動(dòng)劑對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞抗脂質(zhì)過(guò)氧化損傷和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生可能具有重要意義.2.MHEC能升高ApoE-/-小鼠HDL-C水平且沒(méi)有升高TG的不良作用,具有較好的改善血脂表現(xiàn).LXR激動(dòng)劑使ApoE-/-小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化程度明

10、顯降低,LXR激動(dòng)劑的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用可能不依賴于血脂的改變,也與LXR激動(dòng)劑的亞型選擇性無(wú)關(guān),不同的LXR激動(dòng)劑可能有著主要的共同的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用機(jī)制.3.MHEC和T-0901317均使ApoE-/-小鼠粥樣病變組織中ABCA1的表達(dá)明顯增加,提示促進(jìn)ABCA1表達(dá)增加,加強(qiáng)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn),維持機(jī)體膽固醇平衡可能是LXR激動(dòng)劑抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的主要機(jī)制.4.LXR激動(dòng)劑明顯抑制粥樣病變組織中iNOS表達(dá),促進(jìn)血管內(nèi)皮eNOS的