SKI-II對SGC7901-DDP耐藥逆轉(zhuǎn)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:探討神經(jīng)鞘氨醇激酶抑制劑SKIⅡ(SKIⅡ)逆轉(zhuǎn)DDP對SGC7901/DDP細(xì)胞的作用及其作用機(jī)制。
　　 方法:胃癌順鉑耐藥細(xì)胞SGC7901/DDP常規(guī)培養(yǎng)于含10％小牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中,在37℃、5％CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),予以SKIⅡ20μmol/L、DDP2.5mg/L、Cer5μmol/L、SKIⅡ20μmol/L+DDP2.5mg/L、SKIⅡ

2、20μmol/L+Cer5pmol/L、DDP2.5mg/L+Cer5μmol/L作用后:1.四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法分別檢測各組細(xì)胞24h、48h、72h體外增殖情況;2.形態(tài)學(xué)染色:用HE染色后觀察各組細(xì)胞24h、48h、72h形態(tài)學(xué)變化;3.電鏡觀察:藥物作用48h后SGC7901/DDP細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變;4.流式細(xì)胞術(shù)檢測各用藥組作用于SGC7901/DDP后的細(xì)胞凋亡率;5.流式細(xì)胞術(shù)檢測各組作用于SGC7901/DDP細(xì)胞

3、后的細(xì)胞周期;6.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測各組細(xì)胞中Sphk1、P-gp、P27、NF-KB、Bcl-2、Bax的蛋白表達(dá)情況;7.免疫印跡法檢測各組細(xì)胞中Sphk1、P-gP、P27、NF-KB、Bcl-2、Bax的蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.各組藥物作用于SGC7901/DDP細(xì)胞24h、48h、72h后,SKIⅡ20μmol/L及Cer5μmol/L單獨(dú)用藥組細(xì)胞增殖抑制明顯,與對照組比P＜0.05,DDP2.

4、5mg/L組細(xì)胞增殖情況與陰性對照組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,聯(lián)合SKIⅡ20μmol/L或者Cer5μmol/L后細(xì)胞增殖受到顯著抑制,與陰性對照組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且比SKIⅡ20μmol/L、Cer5μmol/L及DDP2.5mg/L單獨(dú)用藥組抑制作用強(qiáng),SKIⅡ作用于SGC7901/DDP細(xì)胞后,隨著濃度的升高,時間的延長,抑制作用越來越明顯;
　　 2.光鏡下觀察到DDP2.5mg/L組作用于胃癌SGC7901/D

5、DP細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)與對照組相比無明顯差異,但是聯(lián)合SKIⅡ20μmol/L或Cer5μmol/L組后胃癌SGC7901/DDP細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞體積變小,形態(tài)不規(guī)則,細(xì)胞皺縮,核固縮等形態(tài)學(xué)表現(xiàn),其余各用藥組也出現(xiàn)類似的形態(tài)學(xué)表現(xiàn);
　　 3.電鏡下觀察SKIⅡ20μmol/L聯(lián)合DDP組作用于胃癌SGC7901/DDP細(xì)胞48h后可見細(xì)胞體積縮小,相鄰細(xì)胞間的細(xì)胞連接消失,細(xì)胞內(nèi)見空泡狀物質(zhì),凋亡細(xì)胞胞核染色質(zhì)固縮、邊集,核膜皺褶,

6、胞質(zhì)緊實(shí),細(xì)胞器集中,可見凋亡小體;
　　 4.細(xì)胞凋亡率分析顯示:各組藥物作用于細(xì)胞48h后,DDP2.5mg/L組凋亡率與對照組相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,聯(lián)合SKIⅡ20pμmol/L或者Cer5μmol/L后凋亡率顯著高于對照組,且比DDP、SKIⅡ及Cer單用組凋亡率高,SKIⅡ20μmol/L及Cer5μmol/L單獨(dú)及聯(lián)合用藥組細(xì)胞與對照組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　　 5.細(xì)胞周期分析顯示:各用藥組作用48小時后

7、,DDP2.5mg/L組G0/G1期細(xì)胞與陰性對照組相比無明顯差異,聯(lián)合SKIⅡ20μmol/L或Cer5μmol/L組后處于G0/G1期細(xì)胞明顯增多,其余用藥組與陰性對照組相比P＜0.05。
　　 6.免疫細(xì)胞化學(xué)染色及Western blot結(jié)果顯示:各用藥組作用48小時后,DDP2.5mg/L組各相關(guān)蛋白表達(dá)與對照組相比無明顯差異,陽性對照組Cer5μmol/L及Cer5μmol/L+DDP2.5mg/L組Sphk1蛋白表

8、達(dá)與對照組相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,Bax、P27表達(dá)增加,NF-κB、P-gp、Bcl-2表達(dá)減少,其余用藥組作用后各蛋白表達(dá)與對照組相比有明顯差異。Pearson相關(guān)性分析顯示:Sphk1與P-gp、NF-κB的表達(dá)呈正相關(guān),與P27的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),NF-κB和Bcl-2的表達(dá)呈正相關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 1.SKIⅡ逆轉(zhuǎn)了SGC7901/DDP細(xì)胞對化療藥物DDP的耐藥,其機(jī)制與SKIⅡ抑制細(xì)胞內(nèi)Sphk1,提高Ce