馬鞭草提取液對體外培養(yǎng)人早孕蛻膜細胞的影響.pdf

1、計劃生育是中國的一項基本國策,抗生育藥物的研制則是計劃生育工作的重要組成部分.目前臨床抗生育藥物主要是甾體合成藥,作用位點高且多系抗排卵藥物,對機體內分泌有一定的干擾.而中草藥則具有特有的天然療效,作用位點低,副作用小等特點;對馬鞭草有效部位進行提取分離,篩選出其抗生育的有效組分或有效成分,對于開發(fā)新型計劃生育藥物具有非常重要的意義.蛻膜是孕卵著床和胚胎發(fā)育所必須的組織,用藥物干擾蛻膜的發(fā)育應是理想的抗早孕手段.體外細胞培養(yǎng)以其直觀、便

2、利展現(xiàn)了其獨特的優(yōu)越性.馬鞭草有破血通經(jīng)、利尿消腫等作用,孕婦忌用.該院曾對76例停經(jīng)33-42天健康早孕婦女口服馬鞭草粉劑,流產(chǎn)成功率達83.4﹪.孕早期人絨毛組織體外培養(yǎng)顯示,馬鞭草能明顯抑制絨毛生長及滋養(yǎng)層細胞分泌HCG的功能;動物實驗表明,馬鞭草也能明顯抑制胚胎生長而使其固縮死亡,破壞滋養(yǎng)層細胞,對小鼠有明顯的抗早孕作用.但對馬鞭草是否能抑制蛻膜細胞的生長還不甚清楚,以及對于馬鞭草終止早孕的有效部位的確定國內也尚未有報道.中藥抗

3、生育效果良好,副作用小;服用方便,已成為各國當前日益關注的課題.目前,應用中草藥抗孕方面的研究雖然有些報道,但缺乏基礎細胞等方面深入的研究.該研究目的首先是進行蛻膜基質細胞的體外培養(yǎng),并對其培養(yǎng)方法做了一定的改進,然后觀察經(jīng)不同提取途徑獲得的馬鞭草提取液A、B、C、D及米非司酮對蛻膜細胞形態(tài),增殖,細胞凋亡及細胞周期動力學的影響.從而了解馬鞭草抗生育的機制及有效抗生育作用組分及作用位點.第一部分人類蛻膜基質細胞體外培養(yǎng)的研究目的:建立良

4、好的人類蛻膜機質細胞培養(yǎng)方法.方法:實驗選用早孕人工流產(chǎn)蛻膜組織進行體外培養(yǎng),配制FD完全培養(yǎng)液及0.25﹪胰蛋白酶和0.02﹪EDTA(1:1)消化液,進行全組分蛻膜細胞培養(yǎng),24小時后換液,清除未貼壁的蛻膜細胞及紅細胞.視細胞生長情況,2~3天換培養(yǎng)液一次.待細胞融合達80﹪時,用0.25﹪胰蛋白酶與0.02EDTA(1:1)消化貼壁細胞,傳代.利用傳三代的方法對蛻膜基質細胞進行分離提純.傳三代時部分細胞用蓋片法培養(yǎng),制作細胞爬片,

5、用泌乳素(prolactin PRL)免疫組化試劑盒檢測培養(yǎng)細胞成分,鑒定細胞純度.結論:該實驗方法經(jīng)濟實用、簡單,簡化了蛻膜細胞的提純程序,獲得的蛻膜基質細胞純度高.第二部分馬鞭草提取液及米非司酮對體外培養(yǎng)人早孕蛻膜細胞的的影響目的:1.探討馬鞭草及米非司酮抗早孕的細胞學作用機理;2.初步確定馬鞭草抗生育的有效部位.方法:1.取正常妊娠6-9周婦女人工流產(chǎn)的蛻膜組織,進行體外細胞培養(yǎng),傳三代后接種于培養(yǎng)瓶中.培養(yǎng)24小時后,換液,分為

6、含25mg/ml(含馬鞭草生藥)的A、B、C、D組(A、B、C、D分別為馬鞭草石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇提取液,每毫升含生藥1克)及80 ug/ml的米非司酮組及未加藥組.繼續(xù)培養(yǎng)48小時,在倒置顯微鏡下觀察.2.將傳三代后的蛻膜基質細胞接種與三塊96孔培養(yǎng)板,設三復孔.24小時后對照組加入培養(yǎng)液200ul,加藥組分別加含A、B、C、D及米非司酮培養(yǎng)液2 00ul,A、B、C、D的終濃度為1 2.5mg/ml,2 5mg/ml,5 0

7、mg/ml(含馬鞭草生藥).米非司酮的終濃度為80ug/ml.加藥后分別繼續(xù)培養(yǎng)24小時,48小時,72小時.MTT顯色法測各孔的吸光度OD值.3.培養(yǎng)蛻膜基質細胞,傳三代后接種于培養(yǎng)瓶中(共30瓶,平分為6組).培養(yǎng)24小時后,分為加入25mg/ml(含馬鞭草生藥)的A、B、C、D及25mg/ml的米非司酮組及未加藥組.繼續(xù)培養(yǎng)48小時后FACScan流式細胞儀測定熒光強度.對細胞凋亡及細胞周期動力學進行分析.結論:1.馬鞭草的石油醚