檉柳根部響應(yīng)高鹽脅迫基因表達譜的建立及相關(guān)基因克隆.pdf

1、檉柳(Taramix sp.)具有強的耐鹽堿能力，是進行植物耐鹽堿機理研究的理想材料。為研究鹽脅迫下檉柳根部的耐鹽機理，本研究以0.4 mol/L NaCl 脅迫處理剛毛檉柳(Tamarixhispida)根部組織為試材，分別構(gòu)建對照及脅迫24 h、48 h的3個cDNA文庫。3個文庫的初始滴度為1.0×10<'6> pfu、1.4×10<'6>：pfu、1.2×10<'6>pfu，插入片段平均長度分別為0.8 kb、0.9kb、0.8

2、5 kb，平均重組率為98.2％。 通過對3個cDNA文庫克隆的隨機測序共獲得7 726條有效的EST序列，其GenBank注冊號為 EG966290～EG974015，這些EST代表了4 168條無重復(fù)的單一序列(uniquesequence)，其中包括1142條configs和3026條singlets。其中4 508 條EST與與NCBI的Nr數(shù)據(jù)庫中的已知蛋白序列相似，并將它們按功能分成11類，占比例最高的是蛋白質(zhì)合成類

3、(protein synthesis)基因，約21.4％，功能未知(Function unknown)和轉(zhuǎn)運類(Transport facilitation)分別占15％和12.2％，代謝類(Metabolism)占11.2％、細胞防御(Cell rescue，defense)占7.3％、能量(Energy)占7.0％、細胞結(jié)構(gòu)類(Cell structure)6.8％、轉(zhuǎn)錄(Transcription)占5.1％、蛋白質(zhì)定位(Prot

4、ein destination)4.8％、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Signal transduction)占4.1％、細胞生長/分裂(Cell growth，division)占3.7％。 3個cDNA文庫中共有860條EST與抗逆相關(guān)，其中，活性氧清除的基因(27％)、脅迫響應(yīng)(16％)、細胞結(jié)構(gòu)(16％)、蛋白質(zhì)合成及降解基因(10％)，代謝和能量、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)運所占比例次之，轉(zhuǎn)錄調(diào)控和滲透調(diào)物質(zhì)合成基因最少，各占3％。 通過對3

5、個文庫的EST的分析及比較，發(fā)現(xiàn)共有106條基因在NaCl脅迫前后呈差異表達，發(fā)現(xiàn)34條上調(diào)表達基因，27條下調(diào)表達基因，45條基因出現(xiàn)暫時差異表達，其中H<'+>-ATP 合成酶、ABA 脅迫成熟蛋白、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白、金屬硫蛋白、類萌芽素蛋白、晚期胚胎富集蛋白類ERD15和LEA5等基因脅迫后表達豐度上升；而細胞壁結(jié)構(gòu)蛋白富含脯氨酸蛋白及木糖葡聚糖型內(nèi)轉(zhuǎn)運糖基化酶等基因脅迫后表達量下降；蛋白質(zhì)翻譯延伸因子EFlα和翻譯起始因子 eIF

6、5a等基因脅迫后出現(xiàn)瞬時的上升或下降。 采用實時熒光定量PCR技術(shù)，分別研究文庫中獲得的8種POD和7種水通道蛋白基因在NaCl脅迫前后檉柳根和葉組織中的表達差異。結(jié)果表明，鹽脅迫后POD基因在檉柳根和葉組織細胞中的表達模式相同，在脅迫24 h時出現(xiàn)瞬時抑制現(xiàn)象；水通道蛋白基因在鹽脅迫在根、葉器官中有表達模式有明顯的差異。鹽脅迫后7種水通道蛋白基因在根部表達量上升；在葉部它們脅迫后表達量下降。 從文庫中克隆獲得了25條抗

7、逆相關(guān)基因的全長cDNA序列，這些基因這些基因分屬于：細胞防御、離子平衡和轉(zhuǎn)運、抗病、細胞壁成分、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)控、水分脅迫相關(guān)蛋白、蛋白質(zhì)的合成與降解。 從鹽脅迫下檉柳眾多基因的表達特征信息可推斷，檉柳根部對鹽脅迫響應(yīng)的過程可能是一個復(fù)雜的多基因協(xié)同作用的過程，涉及活性氧清除、細胞壁組分、脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因的表達調(diào)控、水分和離子的轉(zhuǎn)運、脫水保護等多種途徑。從而為系統(tǒng)闡明檉柳抗鹽分子機理奠定堅實的基礎(chǔ)。對剛毛檉柳抗逆基因的克隆，可