NaHCO-,3-脅迫下剛毛檉柳基因表達譜的建立及相關(guān)基因的克隆.pdf

1、剛毛檉柳(Tamarix hispid)為灌木或小喬木，具有強的抗旱、耐鹽、耐水濕、抗沙埋能力，是優(yōu)良的防風(fēng)固沙、水土保持和鹽堿地造林樹種。而且能在含鹽量1％的鹽堿地上形成自然林，為鹽堿土指示植物，是進行植物抗鹽堿研究的理想材料。本文研究了剛毛檉柳在鹽堿脅迫后不同時間點基因的表達，并克隆出抗逆相關(guān)基因。 剛毛檉柳在0.4 mol/LNaHCO<,3>脅迫下，分別處理0h(對照)、24 h和52h，以葉片為材料，分別構(gòu)建了3個全長

2、cDNA文庫。文庫的滴度分別為7.5×10<'5>pfu、2.6×10<'6>pfu、4.0×10<'6>pfu，插入片段平均長度分別為1.1、1.2和1.2 kb，平均重組率為97.5％。 共獲得9447條高質(zhì)量的ESTs序列，其登錄號為EH048198-EH057644。它們代表了3945條單一基因序列(Unigene)，包括986個contigs和2959個singlets。3個文庫具有的Unigene分別是1752、15

3、58和1675。將9447條EST序列與GenBank的Nr數(shù)據(jù)庫進行Blastx和Blastn分析，其qb7365條ESTs(占77.96％)與已知基因序列相似性高(E-value<10<'-4>)，其余2082(22.04％)條相似性低或沒有相似性。與已知基因序列相似性高的7365條序列按功能分為12類，其中光合(photosynthesis)占20.31％，功能未知(functionunknown)占13.97％、細胞防御(Cel

4、l rescue，defense)占13.96％、能量(Energy)占7.59％、蛋白質(zhì)合成(Protein synthesis)占7.58％、轉(zhuǎn)運(Transport facilitation)占7.28％、轉(zhuǎn)錄(Transcription)占6.63％、細胞結(jié)構(gòu)(Cell structure)占6.07％、代謝(Metabolism)占5.70％、蛋白質(zhì)定位(Protein destination)占5.02％、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Sign

5、altransduction)占3.86％、細胞生長/分裂(Cell growth，division)占2.04％。 通過對3個cDNA文庫分別進行EST分析和比較建立了NaHCO<,3>脅迫不同時間點的檉柳基因表達譜，鑒定了大量的鹽堿脅迫響應(yīng)基因。這些基因按功能可以分為：滲透調(diào)節(jié)、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、活性氧清除、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白合成和定位、離子平衡、核糖體蛋白、光合作用和代謝等。提示這些途徑都可能參與了剛毛檉柳的耐鹽堿脅迫。

6、在文庫中選擇了9個表達明顯差異的基因，利用實時定量(real time)RT-PCR技術(shù)，研究比較了這些基因在NaCl和NaHCO<,3>脅迫下基因表達模式，發(fā)現(xiàn)在NaCl或NaHCO<,3>脅迫24 h后這些基因表達趨勢比較相似。但在脅迫52 h后，這些基因?qū)aCl和NaHCO<,3>脅迫響應(yīng)表達趨勢出現(xiàn)明顯差異。 文庫中含有較多的抗逆相關(guān)全長基因，從中選擇了液泡膜H<'+>-ATPase C、c″亞基和2個GRP(glyc

7、ine-rich RNA-binding protein)基因，對它們在NaHCO<,3>和NaCl脅迫下基因的表達進一步的分析。NaCI脅迫后 ThVHA cl和 Th VHA c″1，表達量明顯增加，ThGRP1和ThGRP2基因表達量下降；NaHCO<,3>脅迫后 Th VHA cl 和 ThVHA C″1的表達量在24 h下降，52 h上升，而ThGRP1和ThGRP2為24 h上升，52 h下降。 本研究發(fā)現(xiàn)剛毛檉柳對