EGCG的抗前列腺癌作用與IGF信號通路系統(tǒng)的關(guān)系及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:前列腺癌高居歐美男性惡性腫瘤發(fā)病率榜首,男性惡性腫瘤死亡率第二位。前列腺癌的發(fā)病率在我國雖然較西方國家低,但是發(fā)病率逐年上升的趨勢十分明顯,嚴(yán)重危害著中老年男性的健康。因此前列腺癌的預(yù)防和治療一直是泌尿外科研究的重點(diǎn)與熱點(diǎn)之一。
　　 許多國內(nèi)外流行病學(xué)及實驗室研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn),茶的攝入習(xí)慣與我國前列腺癌發(fā)病率一直偏低有密切關(guān)系,而飲茶等生活習(xí)慣的改變,也與我國前列腺癌發(fā)病率的變化趨勢高度相關(guān)。茶及其提取物在前列腺癌的發(fā)生

2、發(fā)展中起到了重要作用。
　　 茶葉中的主要成分是茶多酚,EGCG又是茶多酚中的主要單體成分。大量研究證實茶多酚對前列腺癌、皮膚癌、胃癌、食道癌、直腸癌、乳腺癌、肝癌、肺癌等人體大多數(shù)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有抑制作用。但目前茶及其提取物(主要是EGCG)對前列腺癌的作用機(jī)制尚不明了,許多研究也正將EGCG作為前列腺癌化學(xué)防治的重要研究方向。有相關(guān)文獻(xiàn)指出,茶的抗癌作用可能是多重的,包括誘導(dǎo)凋亡,周期阻滯,抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移,抗氧化作用、抑

3、制端粒酶活性和信號傳導(dǎo)調(diào)控等方面。
　　 胰島素樣生長因子系統(tǒng)(Insulin-like growth factor system,IGFS)包括2種多肽類激素(IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ),多種細(xì)胞膜受體(如IGF-IR),以及至少6種結(jié)合蛋白(IGFBPs),IGFS信號通路也在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著十分關(guān)鍵的作用。其家族中的數(shù)種血清因子在腫瘤患者血清中的水平都有異常改變,家族中的數(shù)種蛋白也在多種腫瘤組織和細(xì)胞中過度表達(dá),這些

4、既可以作為腫瘤發(fā)生的診斷標(biāo)記,也可以作為具有廣泛前景的腫瘤治療靶點(diǎn)。有研究提示,EGCG對IGF信號通路系統(tǒng)也有多種重要作用。
　　 為了研究EGCG的抗前列腺癌作用,了解其抗癌機(jī)制與IGF信號通路系統(tǒng)的關(guān)系,我們提出如下假說:EGCG可以通過抑制人胰島素樣生長因子(IGF)信號通路,減少細(xì)胞自分泌IGF量等機(jī)制發(fā)揮作用,調(diào)節(jié)IGF系統(tǒng)下游癌基因的表達(dá),從而促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡,抑制癌細(xì)胞生長,起到抗癌作用。
　　 我們用EL

5、ISA法檢測了IGF-Ⅰ,IGF-Ⅱ在正常人、良性前列腺增生及前列腺癌患者血清中含量的情況,并通過體外實驗觀察EGCG對人前列腺癌PC3細(xì)胞的抑癌作用,并從EGCG對IGF信號通路系統(tǒng)的調(diào)控方式方面對其抗前列腺癌作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。
　　 第一章、前列腺癌患者血清中IGF-Ⅰ及IGF-Ⅱ的含量及其臨床意義的研究
　　 目的:探討IGF-Ⅰ及IGF-Ⅱ在前列腺癌患者血清中的含量水平及其意義。
　　 方法:用酶聯(lián)免

6、疫法(ELISA)檢測IGF-Ⅰ在28例前列腺癌患者、20例前列腺增生患者及20例正常健康男性血清中的含量情況,并分析其可能的臨床意義。
　　 結(jié)果:前列腺癌組患者血清IGF-Ⅰ水平(491.6±74.1ng/ml)高于前列腺增生(296.0±87.8ng/ml)組(P＜0.05),也高于正常對照(232.1±95.7ng/ml)組(P＜0.05)。前列腺癌組患者血清IGF-Ⅱ水平(257.7±62.9ng/mll高于前列腺增生

7、(161.0±52.4ng/ml)組(P＜0.05)及正常對照(160.8±59.2ng/ml)組(P＜0.05)。高危組前列腺癌患者血清IGF-Ⅱ水平(298.7±41.8ng/ml)高于低危組前列腺癌患者血清IGF-Ⅱ水平(203.5±48.3 ng/ml),兩者的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。高危組前列腺癌患者IGF-Ⅰ水平(500.1±57.8ng/ml)比低危組前列腺癌患者IGF-Ⅰ水平(480.2±96.6ng/ml)稍

8、高,但兩者之間并無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。前列腺增生組與正常對照組比較,IGF-Ⅰ水平及IGF-Ⅱ水平統(tǒng)計學(xué)差異均無顯著性(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.血清IGF-Ⅰ及IGF-Ⅱ水平的升高可能增加了前列腺癌的危險性,血清IGF-Ⅰ及IGF-Ⅱ水平的檢測可以作為一個新的檢測指標(biāo)預(yù)測高危人群,進(jìn)行早期診斷；
　　 2.血清IGF-Ⅱ水平與前列腺癌臨床進(jìn)展危險程度有關(guān),血清IGF-Ⅱ水平的檢測對評

9、價前列腺癌臨床進(jìn)展風(fēng)險、判斷前列腺癌患者預(yù)后等均有一定意義。
　　 第二章、EGCG及外源性IGF對人前列腺癌PC3細(xì)胞體外生長影響的實驗研究
　　 目的:探討EGCG對人前列腺癌PC3細(xì)胞體外生長的影響。
　　 方法:設(shè)定不同濃度的EGCG作用于PC3細(xì)胞不同時間后,利用MTT法檢測對細(xì)胞增殖的作用,流式細(xì)胞術(shù)檢測PC3細(xì)胞的凋亡指數(shù)情況。與EGCG以不同的組合方式加入外源性IGF-Ⅰ/IGF-Ⅱ刺激PC3細(xì)胞

10、,觀察對PC3細(xì)胞增殖及凋亡的影響
　　 結(jié)果:MTT法檢測EGCG(0、20、40、60ng/ml)作用于PC3細(xì)胞后對細(xì)胞增殖的作用,20ng/ml EGCG對PC3細(xì)胞作用24h后即可顯著抑制人前列腺癌PC3細(xì)胞的生長(P＜0.001),細(xì)胞平均抑制率為27.7％,細(xì)胞存活率隨培養(yǎng)時間的延長而降低,20ng/ml EGCG時24h,48h,72h細(xì)胞平均存活率分別為72.3％,52.5％,44.6％,EGCG對細(xì)胞增殖的抑

11、制呈現(xiàn)明顯的時間效應(yīng)關(guān)系,在其它濃度組也有同樣表現(xiàn)。在同一時間段內(nèi),隨EGCG作用濃度的增加,各組細(xì)胞的存活率也逐漸下降,20、40、60ng/ml EGCG作用24h后細(xì)胞平均存活率分別為72.3％,68.2％,50.3％,呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系,在其它時間組也有同樣表現(xiàn)。外源性IGF-Ⅰ、IGF-Ⅰ工作用于PC3細(xì)胞后,可以明顯刺激細(xì)胞增殖。EGCG可以阻斷外源性IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ的作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率,不同濃度組EGC

12、G作用PC3細(xì)胞24h,對照組的細(xì)胞早期凋亡率是(1.37±0.006)％,EGCG處理20ng/ml組的凋亡率是(2.82±0.018)％,40ng/ml處理組的凋亡率是(3.45±0.022)％,60ng/ml處理組的凋亡率是(5.25±0.024)％:各濃度組與對照組的細(xì)胞凋亡率相比差異性顯著(P＜0.05),并各組之間也有顯著差異,呈明顯劑量依賴性關(guān)系(P＜0.05)。EGCG作用時間延長至48h,72h后,凋亡率也隨之進(jìn)一步增

13、加,均與對照組相比有顯著差異(P＜0.05),且在同一EGCG作用濃度下,EGCG誘導(dǎo)凋亡能力也呈明顯時間依賴性關(guān)系。外源性IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ作用于PC3細(xì)胞后,可以明顯抑制細(xì)胞凋亡。EGCG可以阻斷外源性IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ的作用。
　　 結(jié)論:
　　 1.EGCG作用于PC3細(xì)胞后,對PC3細(xì)胞的生長有明顯抑制作用,并且呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系及時間效應(yīng)關(guān)系。
　　 2.EGCG作用于PC3細(xì)胞后,明顯誘導(dǎo)

14、細(xì)胞凋亡,凋亡的誘導(dǎo)作用呈顯著劑量效應(yīng)關(guān)系及時間效應(yīng)關(guān)系
　　 3.外源性IGF-Ⅰ、IGF-Ⅰ工作用于PC3細(xì)胞后,可以明顯刺激細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡。EGCG可以阻斷外源性IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ的作用。
　　 第三章、EGCG抑制PC3細(xì)胞生長的機(jī)制及與IGF信號通路系統(tǒng)關(guān)系的實驗研究
　　 目的:探討EGCG抑制人前列腺癌PC3細(xì)胞的分子生物學(xué)機(jī)制與IGF信號系統(tǒng)的關(guān)系。
　　 方法:設(shè)定不同濃度E

15、GCG作用于PC3細(xì)胞不同時間,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液測定IGF-Ⅰ,IGF-Ⅱ的含量水平。再設(shè)20ng/ml EGCG與15μ M IGF-Ⅰ或15μ M IGF-Ⅱ以不同組合共同作用于PC3細(xì)胞,半定量RT-PCR檢測PC3細(xì)胞的IGF-Ⅰ,IGF-Ⅱ mRNA的變化,Westernblot檢測p-ⅠGF-Ⅰ R、p-AKT蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:PC3細(xì)胞培育24h后,培養(yǎng)上清液中有IGF-Ⅰ及IGF-Ⅱ分泌,IGF-Ⅰ穩(wěn)定

16、在(109.9±6.6ng/ml),IGF-Ⅱ濃度為(76.1±2.3ng/ml)。20ng/ml EGCG作用24h可以使自分泌的IGF-Ⅰ及IGF-Ⅱ明顯減少(P＜0.05),隨著EGCG作用濃度增加及作用時間延長,PC3細(xì)胞自分泌IGF-Ⅰ及IGF-Ⅱ隨之減少,呈顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系及時間效應(yīng)關(guān)系。
　　 結(jié)論:
　　 1.人前列腺癌PC3細(xì)胞生長過程中可以向細(xì)胞培養(yǎng)基分泌IGF-I和IGF-Ⅱ,EGCG可以減少PC

17、3細(xì)胞IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ的自分泌水平,并呈明顯時間和劑量效應(yīng)關(guān)系。
　　 2.人前列腺癌PC3細(xì)胞的IGF-Ⅰ mRNA及IGF-Ⅱ mRNA表達(dá)能被EGCG所抑制,外源性IGF-Ⅱ可以刺激PC3細(xì)胞IGF-Ⅰ mRNA及IGF-Ⅱ mRNA表達(dá)上調(diào),并且該刺激作用可以被EGCG所阻斷。
　　 3.外源性IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ可以上調(diào)IGF信號通路系統(tǒng)中的關(guān)鍵因子p-ⅠGF-1β R的蛋白及p-Akt蛋白表達(dá),EGC