DAB2IP抑制前列腺癌雄激素受體信號(hào)通路的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中生物學(xué)行為最復(fù)雜的惡性腫瘤。作為一種典型的雄激素依賴性腫瘤，根治性前列腺切除術(shù)與去勢(shì)治療（睪丸切除和/或藥物去勢(shì)）是PCa常規(guī)的治療方式。最初多數(shù)患者可獲得滿意的療效，但多在2年內(nèi)復(fù)發(fā)，發(fā)展為去勢(shì)抵抗型腫瘤（castration resistant prostate cancer，CRPC）。CRPC對(duì)激素治療無(wú)效，對(duì)放化療不敏感，導(dǎo)致患者因臨床

2、難治、廣泛轉(zhuǎn)移而死亡。目前其發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制仍不清楚。
　　持續(xù)活化的雄激素受體（androgen receptor, AR）信號(hào)通路被認(rèn)為在CRPC發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色。盡管去勢(shì)可以有效降低PCa患者血清中雄激素水平，但由于前列腺局部雄激素高水平和AR本身活性的增強(qiáng)，使得PCa在低水平雄激素配體的刺激下仍能夠繼續(xù)生長(zhǎng)，繼而引起CRPC的發(fā)生。多種復(fù)雜的分子機(jī)制參與了CRPC中AR信號(hào)通路的持續(xù)活化：（1）AR基因擴(kuò)增，

3、表達(dá)增加；（2）AR基因突變，可被非特異性配體激活；（3）AR剪接突變體產(chǎn)生，如配體結(jié)合域（ligand binding domain, LBD）缺失，無(wú)需配體結(jié)合即持續(xù)活化；（4）AR蛋白分子伴侶改變，如共激活因子（coactivator）或共抑制因子（corepressor）改變；（5）與其它信號(hào)通路相互作用。
　　DAB2IP是Ras-鳥苷三磷酸酶激活蛋白（Ras GTPase activating protein，Ras-

4、GAP）家族的新成員。作為一種抑癌基因，其表達(dá)在多種類型腫瘤組織細(xì)胞中普遍缺失。全基因組關(guān)聯(lián)研究提示，DAB2IP基因的單核苷酸多態(tài)性與高度惡性前列腺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)密切相關(guān)。免疫組化結(jié)果證實(shí)，其在前列腺上皮內(nèi)瘤與PCa中的表達(dá)低于正常前列腺上皮，且隨著Gleason評(píng)分的增加表達(dá)顯著減少。目前研究認(rèn)為，DAB2IP是維系前列腺上皮細(xì)胞自身穩(wěn)定的重要分子支架蛋白，協(xié)調(diào)細(xì)胞內(nèi)部多種信號(hào)通路的平衡，如PI3K-Akt、Ask1-JNK、Wn

5、t/β-catenin和Ras-NF?B，其表達(dá)缺失可促發(fā)細(xì)胞內(nèi)部信號(hào)紊亂，引起PCa細(xì)胞耐受凋亡、生長(zhǎng)失控和侵襲轉(zhuǎn)移。
　　DAB2IP缺失是否在CRPC的發(fā)生、發(fā)展過程中起到作用，是否參與了AR信號(hào)通路持續(xù)活化過程的調(diào)控？其確切的作用分子機(jī)制是什么？目前尚不清楚。
　　目的：
　　本試驗(yàn)旨在通過細(xì)胞、基因敲除小鼠、人組織標(biāo)本三個(gè)層次，探討 DAB2IP表達(dá)變化對(duì)多種途徑（雄激素配體、Wnt非配體、無(wú)雄激素配體）介導(dǎo)

6、 AR信號(hào)通路激活和PCa細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，研究DAB2IP在PCa由雄激素依賴到非依賴轉(zhuǎn)變過程中可能的作用，并初步探討其作用可能的分子機(jī)制，為闡明 CRPC發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制并尋找PCa新的治療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.利用構(gòu)建的穩(wěn)定過表達(dá) DAB2IP的前列腺癌 C4-2細(xì)胞和穩(wěn)定低表達(dá) DAB2IP的永生化正常前列腺PZ-HPV-7細(xì)胞，應(yīng)用MTT、Pull-down、免疫共沉淀、Western blot檢測(cè) D

7、AB2IP表達(dá)變化對(duì)雄激素刺激誘導(dǎo)的前列腺（癌）細(xì)胞的體外生長(zhǎng)能力和AR非基因組信號(hào)通路的影響；
　　2.利用上述穩(wěn)定過表達(dá)或低表達(dá) DAB2IP的前列腺（癌）細(xì)胞，應(yīng)用 RT-PCR、染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）、熒光素酶報(bào)告基因、Western blot、免疫熒光染色-激光共聚焦檢測(cè)DAB2IP表達(dá)變化對(duì)雄激素刺激誘導(dǎo)的AR特異性靶基因表達(dá)、AR磷酸化和AR細(xì)胞核轉(zhuǎn)位的影響；
　　3.對(duì)比DAB2IP基因敲除小鼠（DAB

8、2IP-/-）和野生型小鼠（DAB2IP+/+）前列腺組織中AR的表達(dá)。H&E染色對(duì)比兩種小鼠前列腺組織形態(tài)學(xué)差異；免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)兩種小鼠去勢(shì)、睪酮補(bǔ)給前后前列腺組織AR表達(dá)的差異；Western blot檢測(cè)兩種小鼠去勢(shì)、睪酮補(bǔ)給前后前列腺組織AR磷酸化、Src-Erk磷酸化的差異；
　　4.應(yīng)用 Wnt條件培養(yǎng)基（Wnt3a-CM）干預(yù)或在去雄激素條件下過表達(dá)不同的持續(xù)活化的AR剪接突變體（ARv7、AR3和ARv567

9、es）來(lái)激活A(yù)R，應(yīng)用Western blot和熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) DAB2IP表達(dá)變化對(duì)這些非配體或無(wú)配體激活的AR活性的影響；
　　5.利用組織芯片（TMA）免疫組織化學(xué)染色，分析前列腺癌組織標(biāo)本中 DAB2IP和AR的表達(dá)及相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1. DAB2IP過表達(dá)可抑制雄激素誘導(dǎo)的C4-2細(xì)胞體外增殖、Src-Erk磷酸化，而DAB2IP敲除可增強(qiáng)雄激素誘導(dǎo)的PZ-HPV-7細(xì)胞體外增殖、Src-Er

10、k磷酸化；DAB2IP可通過其PR結(jié)構(gòu)域與Src的SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合；DAB2IP結(jié)合Src可抑制Src及下游Erk的磷酸化；DAB2IP結(jié)合Src還可競(jìng)爭(zhēng)性抑制AR與Src間相互作用。
　　2. DAB2IP過表達(dá)可抑制雄激素誘導(dǎo)的C4-2細(xì)胞AR靶基因（如PSA、PDE9A和TMPRSS2）mRNA的表達(dá)，抑制AR與這些靶基因啟動(dòng)子或ARE的結(jié)合，抑制PSA蛋白的表達(dá)；DAB2IP過表達(dá)可抑制雄激素誘導(dǎo)的AR核轉(zhuǎn)位；DAB2IP

11、過表達(dá)可抑制雄激素誘導(dǎo)的AR Ser81位點(diǎn)磷酸化；特異性化學(xué)抑制劑抑制PP2A活性或siRNA敲除PP2A可逆轉(zhuǎn)DAB2IP對(duì)AR Ser81位點(diǎn)磷酸化、ARE活性的抑制作用。
　　3. DAB2IP基因敲除小鼠（DAB2IP-/-）前列腺發(fā)生不良增生，其AR胞核染色、
　　AR磷酸化、Src-Erk磷酸化均高于野生型小鼠（DAB2IP+/+）；尤其在去勢(shì)并重新補(bǔ)給睪酮后，AR胞核染色、AR磷酸化、Src-Erk磷酸化的升

12、高顯著強(qiáng)于野生型小鼠。
　　4. DAB2IP過表達(dá)可抑制Wnt誘導(dǎo)的AR Ser81位點(diǎn)磷酸化、ARE活性和PSA蛋白的表達(dá)；DAB2IP過表達(dá)可抑制多種不同AR剪接突變體（ARv7、AR3和ARv567es）介導(dǎo)的持續(xù)的AR Ser81磷酸化、ARE活性和Src-Erk磷酸化；siRNA敲除PP2A可逆轉(zhuǎn)DAB2IP對(duì)AR剪接突變體介導(dǎo)的AR Ser81位點(diǎn)磷酸化、ARE活性的抑制作用。
　　5.在CRPC臨床標(biāo)本中DA

13、B2IP染色顯著降低，其表達(dá)與AR胞核染色呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1. DAB2IP可通過其特異性的PR結(jié)構(gòu)域結(jié)合Src并抑制其磷酸化，繼而抑制雄激素誘導(dǎo)的AR非基因組信號(hào)，影響PCa細(xì)胞的體外增殖能力。
　　2. DAB2IP可抑制多種途徑（雄激素配體、Wnt非配體、無(wú)雄激素配體）介導(dǎo)的AR靶基因的表達(dá)、AR Ser81位點(diǎn)磷酸化和AR的核轉(zhuǎn)位；其中PP2A參與了DAB2IP對(duì)AR磷酸化、AR轉(zhuǎn)錄活性的抑制過程。