一新的人結(jié)外鼻型NK-T細(xì)胞淋巴瘤裸鼠模型鑒定與CYR61基因在該腫瘤中的表達(dá)及意義.pdf

1、結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤(Extranodal nasal type NK／T celllymphoma)是一類具有特殊形態(tài)、免疫表型和生物學(xué)行為的腫瘤，多原發(fā)于淋巴結(jié)外器官或組織，存在高水平EB病毒感染。人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤在亞洲地區(qū)，而在西方發(fā)達(dá)國家和地區(qū)則罕見。在中國，該腫瘤約占所有非霍奇金淋巴瘤的15％，可以說該腫瘤是我國的“特產(chǎn)”之一。 由于該腫瘤的病變部位的特殊，主要是在中線面部，如鼻腔和咽部等處，且活檢組

2、織多較小，在完成外科病理診斷后所剩無幾。由于研究材料的限制，嚴(yán)重制約了對這一特殊類型腫瘤的深入研究。因此，人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤裸鼠模型的建立不僅可以解決該腫瘤研究材料匱乏的問題，同時由于模擬了該腫瘤在人體內(nèi)生長情況，對該腫瘤發(fā)病的分子機制、腫瘤的演進(jìn)、治療及藥物篩選的進(jìn)一步深入研究有重要的實用價值。到目前為止，國外僅有少數(shù)幾個鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系的報道。在國內(nèi)外尚未見到有關(guān)人類結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤腫瘤組織塊直接埋入

3、裸鼠皮下而建成該腫瘤動物模型的報道。 近年來，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了一個新的基因家族，該家族成員蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)高度保守而生物學(xué)功能各不相同。由于CYR61、CTGF和nov是這個家族最初的成員，因此，我們?nèi)匀环Q這個家族為CCN家族。CYR61 (cysteine-rich 6l， angiogerlic indLicer，61或 cysteine-rich heparin-binding protein 61)，屬于早期即刻基因，

4、是CCN家族中第一個被克隆的基因，位于lp22.3，全長2931bp，含有5個外顯子。CYR61蛋白由381個氨基酸殘基構(gòu)成，含有四個結(jié)構(gòu)模塊，分別是胰島素樣生長因子結(jié)合區(qū)域、von Willebrand型結(jié)構(gòu)域、血小板反應(yīng)I型蛋白和C-未端模塊。CYR61是一重要的信號傳導(dǎo)因子，具有與肝素及胰島素樣生長因子選擇性結(jié)合的功能，并參與了細(xì)胞粘附、細(xì)胞增殖、趨化、形態(tài)形成、細(xì)胞生長調(diào)節(jié)、血管形成及刺激反應(yīng)等生理過程，在多種疾病及腫瘤中異常表

5、達(dá)。目前發(fā)現(xiàn)CYR61可能通過以下幾條信號通路在腫瘤生長及其血管形成中發(fā)揮重要作用： (1)CYR61上調(diào)整合素家族(如α v β3、 α6 β l、 α v β 5和α Ⅱ β 3)蛋白的表達(dá)一活化ILK(integrin-linked kinase)→刺激β-catenin的活性和上調(diào)cyclinD1→促進(jìn)細(xì)胞增殖；2 CYR61上調(diào)整合素家族(如αβ 3和αβ 5)蛋白的表達(dá)一刺激NF-κB的活性→XIAP→抑制凋亡；3 VE

6、GF→上調(diào)CYR61→血管形成及微血管密度增加。 本研究嘗試建立人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤的裸鼠模型，并對該模型進(jìn)行一系列鑒定以確立動物模型成功建立。同時還用實時熒光定量PCR及免疫組織化學(xué)技術(shù)對供體人鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤的原發(fā)瘤及繼發(fā)瘤、裸鼠移植瘤和一組鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤病例進(jìn)行了CYR6l基因及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的檢測。旨在建立穩(wěn)定的人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤裸鼠模型，了解CYR6l基因及相關(guān)基因在人結(jié)外鼻型

7、NK／T細(xì)胞淋巴瘤腫瘤組織中的表達(dá)，并探討CYR6l基因及相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄與蛋白水平表達(dá)的相關(guān)性、CYR61基因及相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄與蛋白水平表達(dá)的變化與該腫瘤生物學(xué)行為的關(guān)系以及CYR6l基因及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與蛋白水平表達(dá)的變化與人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤預(yù)后的關(guān)系。 主要研究結(jié)果如下： 1．人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤裸鼠模型的建立與鑒定選擇人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤胃繼發(fā)瘤的腫瘤組織，通過裸鼠移植并傳代，經(jīng)過近三年的嘗試

8、，移植瘤現(xiàn)已傳至第三十代，初步建成該腫瘤的裸鼠模型。該移植瘤從病理形態(tài)、免疫表型、EBV感染以及分子生物學(xué)特征等方面均與人鼻腔原發(fā)瘤和胃轉(zhuǎn)移瘤基本一致。移植瘤中存在人類特異性序列標(biāo)簽位點SY14，經(jīng)熒光原位雜交(FISH)技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)裸鼠移植瘤腫瘤細(xì)胞中含有人類Y染色體，同時裸鼠移植瘤表達(dá)人類白細(xì)胞分化抗原HLA-ABC。 2．CYR61基因及相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄與蛋白水平表達(dá)的檢測用實時熒光定量PCR及免疫組織化學(xué)技術(shù)對供體人結(jié)外鼻型

9、NK／T細(xì)胞淋巴瘤的原發(fā)瘤及繼發(fā)瘤、裸鼠移植瘤以及20例人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤病例進(jìn)行了CYR61 mRNA及VEGF mRNA水平的檢測，并對40例該類腫瘤病例進(jìn)行了CYR61蛋白及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的檢測。結(jié)果示人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤中CYR6l mRNA、VEGFmRNA、CYR6l蛋白、VEGF蛋白、NFkBP65表達(dá)均明顯上調(diào)，其瘤細(xì)胞均不表達(dá)β-CATENIN蛋白，P21蛋白陽性率為48.7％。結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞

10、淋巴瘤病例MVD明顯高于淋巴結(jié)反應(yīng)性增生病例(F=5.672，P=0.022)。 3．CYR61基因及相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性分析 (1)VEGF mRNA與CYR61 mRNA相互關(guān)系的密切程度分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：相關(guān)系數(shù)r=0.499，P=0.025，差異具有顯著性，VEGF mRNA與CYR61mRNA的表達(dá)情況具有較強的相關(guān)性； (2)VEGF和NFkBP65及CYR61蛋白表達(dá)一致性較高，與CYR61表達(dá)之間相關(guān)性強，而P

11、21與CYR61蛋白表達(dá)一致性差，與CYR61表達(dá)之間相關(guān)性弱。 4。CYR6l基因及相關(guān)基因與人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤生物學(xué)行為的關(guān)系 (1)CYR6l基因與血管浸潤的相關(guān)性分析：CYR61 mRNA及cYR6l蛋白表達(dá)均與血管浸潤有關(guān)，有血管浸潤者CYR6l mRNA及CYR6l蛋白表達(dá)水平高于無血管浸潤病例； (2)VEGF基因與血管浸潤的相關(guān)性分析：VEGF mRNA及VEGF蛋白表達(dá)均與血管浸潤有關(guān)，VEGF

12、mRNA及VEGF蛋白在血管浸潤者表達(dá)水平較高； (3)CYR6l及VEGF蛋白表達(dá)與結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤微血管密度有關(guān)，表達(dá)水平較高的病例其微血管密度也較大； (4)CYR61蛋白表達(dá)與Ki-67的相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CYR61與結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖有關(guān)，CYR61蛋白高水平表達(dá)病例的腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)高，細(xì)胞增殖活躍。 綜上所述，本研究直接將人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤的腫瘤組織塊移植于裸鼠，成功建立了

13、該腫瘤的裸鼠模型，該模型再現(xiàn)了人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤的重要生物學(xué)特征，是一較理想的人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤裸鼠模型。到目前為止，在國內(nèi)外尚未見類似報道。人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤中CYR61和VEGF在轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)，可能是人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤的重要事件。VEGF→CYR6l→血管形成及微血管密度增加通路在該腫瘤中具有重要作用，也是CYR61在該腫瘤中發(fā)揮作用的主要機制；同時該腫瘤細(xì)胞NF K B P6