銀杏內(nèi)酯B對大鼠視網(wǎng)膜變性的療效及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、隨著感染性疾病的控制，視網(wǎng)膜變性性疾病已成為主要致盲眼病之一。這類變性性疾病主要受損的是光感受器細(xì)胞，而光感受器細(xì)胞被認(rèn)為是受損后不能再生的神經(jīng)細(xì)胞，故目前尚無理想的治療方法。 對中草藥的研究顯示，某些中草藥的有效成份如銀杏內(nèi)酯等具有神經(jīng)元保護(hù)和抗細(xì)胞凋亡兩方面作用；視網(wǎng)膜是大腦的延伸，光感受器細(xì)胞也是終末分裂的神經(jīng)細(xì)胞，有著復(fù)雜的神經(jīng)活動。因此視網(wǎng)膜變性性疾病治療可借鑒神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的治療，但也有其特殊性。故我們應(yīng)用銀杏內(nèi)酯

2、進(jìn)行防治視網(wǎng)膜變性的實(shí)驗(yàn)研究，探討其藥理機(jī)制，希望能對視網(wǎng)膜變性疾病提供一種新的、有效的治療途徑。本研究共分四部分： 第一部分銀杏內(nèi)酯B對體外培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響目的：采用體外培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的谷氨酸損傷模型，觀察銀杏內(nèi)酯B對體外培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用及可能的作用機(jī)制。 方法：采用體外原代培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，建立谷氨酸損傷的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡模型，與不同濃度的銀杏內(nèi)酯B(Ginkg

3、olideB，GB)共同培養(yǎng)，用噻唑藍(lán)(MTT)法測定神經(jīng)細(xì)胞存活率；流式細(xì)胞儀觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡及其相關(guān)基因Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)。并應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡(Confocal)進(jìn)行線粒體膜電位(MMP)測定。 結(jié)果：谷氨酸(8mmol/L)作用后，視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞存活率降低，bcl-2表達(dá)降低，Bax表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡加重，MMP下降。GB(10～100μmol/L)能劑量依賴性抑制谷氨酸(8mmol/L)引起的細(xì)胞存活率下降。

4、GB干預(yù)后，bcl-2表達(dá)增強(qiáng)，Bax表達(dá)降低，MMP顯著升高，細(xì)胞凋亡明顯減少。 結(jié)論：GB能劑量依賴性對抗谷氨酸興奮性毒性，保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，這一作用可能是通過提升bcl-2表達(dá)、降低Bax表達(dá)和升高視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞MMP來實(shí)現(xiàn)的。 第二部分MNU誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜變性大鼠模型及其凋亡機(jī)制的研究目的：探討N-甲基-N-亞硝脲(N-methyl-N-nitrosourea，MNU)對大鼠視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞毒性作用及其作用機(jī)制

5、。 方法：生后50天的SD大鼠84只，隨機(jī)抽取4只為正常對照組，余下80只分為4大組，每組20只，分別按體重一次性腹腔注射MNU80mg/kg、60mg/kg、40mg/kg和30mg/kg。各組每次4只分別于12h、24h、48、3d、5d行右眼閃光ERG檢查，并于造模后24h、48h、3d、5d、7d處死動物，取眼球做病理切片。并通過視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)分析測量中心視網(wǎng)膜的外視網(wǎng)膜厚度(外核層和光感受器細(xì)胞層)；TUNEL試劑盒和透

6、射電鏡檢測光感受器細(xì)胞凋亡；免疫組織化學(xué)方法檢測MNU作用不同時間大鼠視網(wǎng)膜中Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達(dá)。 結(jié)果：1.ERG觀察：正常對照組的大鼠ERG波形清晰，a、b波振幅高。MNU80mg/kg、60mg/kg、40mg/kg和30mg/kg劑量組a波消失時間分別為3h、12h、24h、5d；b波消失時間分別為12h、24h、3d、7d。 2.形態(tài)學(xué)檢查：正常組大鼠中心視網(wǎng)膜的外視網(wǎng)膜厚度為98.4

7、±1.8μm。ⅣMNU處理后5和7d，80mg/kg、60mg/kg、40mg/kg和30mg/kg劑量組外視網(wǎng)膜厚度分別為0μm、9.5±2.3μm、42.8±2.7μm、71.3±2.4μm和0μm、0μm、20.8±2.5μm、62.9±2.0μm，其損傷程度和劑量及時間成正比。 3.透射電鏡觀察：MNU40mg/kg組的大鼠視網(wǎng)膜在24h后，光感受器細(xì)胞開始變小，核染色質(zhì)濃縮；隨給藥劑量的增加，MNU60mg/kg和MN

8、U80mg/kg的大鼠視網(wǎng)膜在24h后，光感受器細(xì)胞變小，核染色質(zhì)濃縮的現(xiàn)象更加明顯。 4.TUNEL檢測：正常對照組未見TUNEL標(biāo)記的陽性細(xì)胞。MNU作用1d，視網(wǎng)膜外核層檢測到陽性凋亡細(xì)胞核，2d時明顯增加，達(dá)高峰；隨后逐漸減少，5d時見少量陽性細(xì)胞核，7d未見TUNEL標(biāo)記的陽性細(xì)胞。 5.免疫組織化學(xué)：正常對照組視網(wǎng)膜各層均未見Bcl-2、Bax和Caspase-3陽性表達(dá)。MNU處理24h后，視網(wǎng)膜外核層可見

9、Bax和Caspase-3陽性表達(dá)，2d時表達(dá)最強(qiáng)，此后逐漸表達(dá)減弱，5d時仍有少量陽性表達(dá)。MNU處理組各時間點(diǎn)均未見視網(wǎng)膜Bcl-2陽性表達(dá)。 結(jié)論：1.MNU可選擇性地誘導(dǎo)視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞發(fā)生凋亡，該作用呈劑量和時間依賴性。 2.MNU誘導(dǎo)視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制可能與上調(diào)Bax和Caspase-3表達(dá)有關(guān)。 第三部分銀杏內(nèi)酯B對MNU誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜變性的保護(hù)作用目的：觀察不同劑量的銀杏內(nèi)酯B對

10、MNU誘導(dǎo)的SD大鼠視網(wǎng)膜變性的保護(hù)作用。 方法：取生后46天的SD大鼠86只，隨機(jī)抽取6只為A組：正常對照組；余下80只分為4大組，每組20只，隨機(jī)分為B組：模型對照組(腹腔注射MNU40mg/kg)，C組：銀杏內(nèi)酯B大劑量組(腹腔注射GB60mg/kg)，D：銀杏內(nèi)酯B中劑量組(腹腔注射GB40mg/kg)，E：銀杏內(nèi)酯B小劑量組(腹腔注射GB20mg/kg)。銀杏內(nèi)酯B治療組于生后46天開始腹腔給藥，每日1次，連續(xù)給藥7日

11、；模型對照組給等量生理鹽水灌胃。第50天模型對照組及銀杏內(nèi)酯B治療組均一次性腹腔注射MNU40mg/kg，建立大鼠視網(wǎng)膜變性模型。各組每次4只分別于24h、48h、3d、5d、7d行右眼閃光ERG檢查，并通過視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)分析測量中心視網(wǎng)膜的外視網(wǎng)膜厚度。 結(jié)果：1.視網(wǎng)膜功能學(xué)檢查：A組ERGa波振幅為105.4±16.8μV，a波潛伏期為22.8±1.3ms；b波振幅為292.6±19.6μV，b波潛伏期為38.8±3.7ms

12、。B組24h后，a波消失，72hERG呈熄滅型。C組2d后，a波消失，b波振幅下降為正常的32％；3d時，其中2只大鼠ERG呈熄滅型，另2只b波振幅下降為正常的8％；5dERG呈熄滅型。D組3d后，a波消失，b波振幅下降為正常的22％；5d時，其中1只大鼠ERG呈熄滅型，另3只b波振幅下降為正常的14％；7dERG呈熄滅型。E組3d后，a波消失，b波振幅下降為正常的20％；5d時，b波振幅下降為正常的14％；7d時b波振幅下降為正常的8

13、％。 2.形態(tài)學(xué)檢查：正常組大鼠中心視網(wǎng)膜的外視網(wǎng)膜厚度為98.4±1.8μm。MNU處理7天B組外視網(wǎng)膜厚度為17.8±2.1μm，而C、D、E組分別為25.2±2.7μm、38.3士2.3μm、45.8±2.3μm。GB各劑量治療組與模型對照組外視網(wǎng)膜厚度比較均可見顯著性差異(P＜0.01)。且C、D、E三組間比較具有顯著性差異(P＜0.01)，可見GB治療組給藥劑量在20～60mg/kg間，呈劑量依賴性。 結(jié)論：銀

14、杏內(nèi)酯B對MNU誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性大鼠視網(wǎng)膜變性所致的大鼠視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞損傷和視功能損害具有保護(hù)作用，并且這種作用呈劑量依賴性。 第四部分銀杏內(nèi)酯B對MNU誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜變性的保護(hù)作用機(jī)制的研究目的：探討銀杏內(nèi)酯B對MNU誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜變性的保護(hù)作用機(jī)制。方法：生后46天的SD大鼠26只，隨機(jī)分為A：正常對照組；B：模型對照組；C：GB治療組。A組6只，其余兩組各10只。GB治療組于生后46天GB40mg/kg灌胃給藥，模型對

15、照組給等量生理鹽水灌胃，并于生后第50天將2組分別按體重一次性腹腔注射MNU40mg/kg，建立大鼠視網(wǎng)膜變性模型。各組每次2只分別于腹腔注射MNU后24h、48h、3d、5d、7d處死動物，取1只大鼠眼球做病理切片，TUNEL試劑盒檢測光感受器細(xì)胞凋亡；免疫組織化學(xué)方法檢測MNU作用不同時間大鼠視網(wǎng)膜中Bcl-2和Bax的表達(dá)。另1只分離出視網(wǎng)膜提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測Bcl-2和BaxmRNA的表達(dá)。

16、 結(jié)果：1.TUNEL檢測：正常對照組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)未見凋亡細(xì)胞核。模型對照組MNU作用1d，視網(wǎng)膜外核層出現(xiàn)TUNEL陽性細(xì)胞核，2d時大量增多，達(dá)高峰，隨后逐漸減少，5d時仍見少量TUNEL陽性細(xì)胞核。GB40mg/kg治療組與模型組比較外核層細(xì)胞凋亡指數(shù)有顯著性差異(P＜0.01)GB40mg/kg治療組在MNU造模后5d時未見TUNEL陽性細(xì)胞核。 2.RT-PCR：Bcl-2/Bax比值顯示：MNU作用后12h、1

17、d、2d、3d和5d，模型對照組二者比值分別為0.36、0.15、0.29、0.42和0.64。GB治療組二者比值分別為0.98、0.92、0.53、0.45、0.68，高于模型組。 3.免疫組織化學(xué)：正常對照組視網(wǎng)膜各層均未見Bcl-2和Bax陽性表達(dá)。模型對照組MNU給藥后各時間點(diǎn)均未見視網(wǎng)膜Bcl-2陽性表達(dá)。MNU給藥后1d，視網(wǎng)膜外核層可見Bax陽性表達(dá)，2d時最強(qiáng)，此后表達(dá)逐漸減弱，5d時仍有少量陽性表達(dá)。GB治療組