皮膚靶向表達(dá)人CTLA4-Ig蛋白延長異種移植皮膚存活的轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究.pdf

1、一、研究目的及背景 轉(zhuǎn)基因動物模型是聯(lián)系分子、細(xì)胞水平研究和整體動物研究的橋梁。皮膚組織特異性表達(dá)CTLA4-Ig轉(zhuǎn)基因動物的建立，可為以異種皮膚移植為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀⒃趧游镎w水平研究CTLA4-Ig分子對異種細(xì)胞性免疫應(yīng)答的調(diào)控功能提供更適宜的動物模型。 隨著異種移植的首要障礙——超急性排斥反應(yīng)(HAR)被有效控制，細(xì)胞性免疫排斥反應(yīng)已逐步成為異種移植的主要免疫學(xué)障礙。皮膚是非血管性器官，其移植后直接面臨急性細(xì)胞性排斥反應(yīng)

2、，且皮膚移植操作簡單，便于觀察和控制，因此異種皮膚移植是研究異種細(xì)胞性免疫應(yīng)答的理想模型。目前，盡管人們對異種細(xì)胞性免疫應(yīng)答的確切機(jī)制還不甚了解，但已有研究表明，T細(xì)胞在異種細(xì)胞性免疫應(yīng)答、尤其在針對非血管化器官(如皮膚、胰島)的異種細(xì)胞性免疫應(yīng)答中仍發(fā)揮主導(dǎo)作用。共刺激信號在T細(xì)胞活化過程中發(fā)揮了重要功能，為調(diào)控T細(xì)胞活化及其介導(dǎo)的免疫應(yīng)答提供了有效靶點(diǎn)。 CTLA4-Ig是功能明確的阻斷T細(xì)胞主要共刺激信號通路——B7-CD

3、28信號通路的免疫調(diào)控蛋白，是調(diào)控異種細(xì)胞性免疫應(yīng)答的理想候選分子。在同種異體移植中，人們利用CTLA4-Ig等免疫調(diào)控分子阻斷T細(xì)胞共刺激信號通路，有效延長了移植器官的存活，甚至誘導(dǎo)供體特異性免疫耐受。但在異種移植中，相關(guān)的研究報道較少，更缺乏深入系統(tǒng)的研究資料。在目前已有的利用CTLA4-Ig分子延長移植物存活的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，大多將純化的CTLA4-Ig蛋白或其重組病毒載體直接應(yīng)用于移植受體，或通過重組病毒載體對移植物進(jìn)行基因修飾。但

4、是，由于CTLA4-Ig抑制T細(xì)胞活化的作用機(jī)制并無抗原特異性，若將其直接全身性、持續(xù)性的作用于機(jī)體，特別是當(dāng)試圖通過加大劑量增強(qiáng)其作用效果時，仍有可能對機(jī)體免疫系統(tǒng)形成非特異性抑制；而通過病毒載體對移植物或受體進(jìn)行基因修飾，只能實(shí)現(xiàn)目的基因的低水平、短暫表達(dá)，并存在由病毒載體引發(fā)的免疫應(yīng)答及生物安全性等問題。 皮膚靶向、高效表達(dá)CTLA4-Ig分子轉(zhuǎn)基因動物的建立，可為研究CTLA4-Ig對異種細(xì)胞性免疫應(yīng)答的調(diào)控提供更適宜的

5、動物模型。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)可實(shí)現(xiàn)CTLA4-Ig分子于移植皮膚持續(xù)、高水平表達(dá)，可使CTLA4-Ig分子在移植皮膚局部持續(xù)性作用于受體免疫系統(tǒng)，使針對移植抗原并浸潤于移植皮膚的活化的T細(xì)胞受到較高濃度的CTLA4-Ig分子的調(diào)控，而受體的其余T細(xì)胞則面對從移植皮膚擴(kuò)散而來的較低濃度的CTLA4-Ig分子。這樣既可更有效的延長移植物的存活時間，充分實(shí)現(xiàn)CTLA4-Ig分子的免疫調(diào)控功能，又可減少CTLA4-Ig分子對受體免疫系統(tǒng)形成非特異性

6、抑制的可能性，并克服在病毒載體介導(dǎo)的基因表達(dá)中存在的水平低、持續(xù)時間短以及由病毒載體引發(fā)的免疫應(yīng)答及生物安全性等問題，且更符合異種移植研究的實(shí)際。 此外，異種皮膚移植是治療大面積燒傷創(chuàng)面的重要手段，但免疫排斥反應(yīng)是移植皮膚存活的主要障礙。如何安全、有效的延長異種移植皮膚的存活是燒傷治療的重要課題。皮膚靶向表達(dá)CTLA4-Ig分子轉(zhuǎn)基因動物的建立，亦可為更安全、有效的延長異種移植皮膚的存活探尋有效途徑。同時，由于轉(zhuǎn)基因物具備可遺傳

7、性，當(dāng)獲得了高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因首建動物以后，便可建立轉(zhuǎn)基因動物品系，由此源源不斷的獲得轉(zhuǎn)基因個體及皮膚，從而免去制備、純化CTLA4-Ig蛋白或其重組病毒載體的過程，大大降低應(yīng)用CTLA4-Ig延長移植皮膚存活的治療成本。 由于具有臨床應(yīng)用前景的異種器官供體主要為豬，且燒傷臨床使用的異種皮亦主要為豬皮，因此研制皮膚靶向表達(dá)人CTLA4-Ig轉(zhuǎn)基因豬是本課題研究的最終目的。但是，由于轉(zhuǎn)基因豬研究的周期長、投資大、風(fēng)險高，因此研制轉(zhuǎn)基因

8、豬之前有必要以小鼠為模型開展前期研究。目前，有關(guān)體內(nèi)表達(dá)CTLA4-Ig分子的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的研究報道很少，僅有的模型分別為Lui.VC(2003)研制的乳腺特異性表達(dá)豬CTLA4-Ig分子和Lane.P(1994)研制的于B細(xì)胞表達(dá)小鼠CTLA4-Ig分子的轉(zhuǎn)基因小鼠。迄今為止，尚未有皮膚組織靶向表達(dá)CTLA4-Ig或其它免疫調(diào)控因子的轉(zhuǎn)基因小鼠的報道。本課題通過建立轉(zhuǎn)基因小鼠制備的技術(shù)體系，首次制備了皮膚靶向、穩(wěn)定、高效表達(dá)人CTL

9、A4-Ig分子的轉(zhuǎn)基因小鼠品系，并以小鼠→鼠異種皮膚移植為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停芯苛薈TLA4-Ig分子于移植皮膚的高水平表達(dá)對其在異種創(chuàng)面的存活及對受體免疫功能的影響，為進(jìn)一步研究CTLA4-Ig分子對異種細(xì)胞性免疫應(yīng)答的調(diào)控功能提供有效的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑸楦踩?、有效地延長移植皮膚的存活以及最終研制臨床移植用遺傳工程皮膚奠定了技術(shù)、實(shí)驗(yàn)及理論基礎(chǔ)。 二、研究內(nèi)容及結(jié)果 在第一部分，本課題系統(tǒng)開展了轉(zhuǎn)基因小鼠制備的方法學(xué)研究，并首次探

10、索了通過雙原核顯微注射提高轉(zhuǎn)基因小鼠研制效率的有效性和可行性。結(jié)果：1)通過向胚胎細(xì)胞原核注射TE溶液，發(fā)現(xiàn)顯微注射雖對胚胎2細(xì)胞卵裂率有一定影響，但仍有66.2％(86/130)的胚胎可實(shí)現(xiàn)2細(xì)胞卵裂，且注射胚胎卵裂后的囊胚發(fā)育率與鮮胚無顯著差異，表明我們所建立的顯微注射方法是可行的；2)DNA溶液的濃度對胚胎注射后的存活和發(fā)育有顯著影響，但當(dāng)DNA濃度為5ng/gL和10ng/gL時，注射胚胎的2細(xì)胞卵裂率和囊胚發(fā)育率與TE溶液注射

11、組無顯著差異，說明該濃度范圍內(nèi)的DNA溶液對胚胎注射后的體外發(fā)育無顯著影響；3)通過輸卵管壺腹部穿刺移植法，將注射后存活的胚胎移植于同期發(fā)情假孕母鼠的膨大壺腹部，可獲得較高的妊娠率(可達(dá)50％)，并可避免常規(guī)傘部移植法中存在的易出血等問題，提高移植成功率；4)通過雙原核顯微注射，轉(zhuǎn)基因首建小鼠的陽性率和轉(zhuǎn)基因小鼠研制效率(轉(zhuǎn)基因陽性小鼠數(shù)量/所注射胚胎總數(shù))分別為27.8％(5/18)和2.08％(5/240)，顯著高于單原核顯微注射組

12、[12.5％(3/24)和1.20％(3/253)，(P＜0.01)]，表明雙原核顯微注射雖在一定程度上降低胚胎注射后的卵裂率，但可顯著提高轉(zhuǎn)基因小鼠的總體研制效率。 在第二部分，構(gòu)建了人CTLA4-Ig基因皮膚組織特異性表達(dá)載體，首次建立了皮膚靶向、高效、穩(wěn)定表達(dá)人CTLA4-Ig轉(zhuǎn)基因小鼠品系。結(jié)果：1)通過平端連接，實(shí)現(xiàn)了CTLA4-Ig編碼序列與K14表達(dá)載體的正向重組，并通過末端測序最終確證了重組方向的正確性以及CTL

13、A4-Ig編碼序列的完整性，說明人CTLA4-Ig皮膚靶向表達(dá)載體(K14/CTLA4-Ig)已被成功構(gòu)建；2)PCR和Southernblot檢測結(jié)果表明，K14/CTLA4-Ig轉(zhuǎn)基因小鼠已被建立，且轉(zhuǎn)基因能完整、穩(wěn)定地傳代，并通過轉(zhuǎn)基因首建小鼠建立了轉(zhuǎn)基因品系；3)RT-PCR和Northernblot檢測表明，CTLA4-Ig蛋白在轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚組織中獲得了特異性高效表達(dá)，其表達(dá)水平與內(nèi)參基因相當(dāng)甚至更高，并在個體發(fā)育與世代傳遞

14、中保持相對穩(wěn)定；4)通過Westernblot在轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚中檢測到高豐度的人CTLA4-Ig蛋白，進(jìn)一步確證了CTLA4-Ig蛋白在皮膚中的穩(wěn)定、高效表達(dá)；5)免疫組化檢測表明，CTLA4-Ig在轉(zhuǎn)基因皮膚中不僅表達(dá)于表皮層，還明顯表達(dá)于真皮層中的毛囊以及腺體細(xì)胞，說明在K14啟動子的驅(qū)動下，CTLA4-Ig不僅在表皮角質(zhì)形成細(xì)胞、而且在真皮層中的毛囊及腺體細(xì)胞中均具有較強(qiáng)的表達(dá)活性；6)通過雙抗體夾心ELISA在轉(zhuǎn)基因小鼠血清中檢

15、測到人CTLA4-Ig蛋白，并通過ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線測定其濃度可達(dá)101.87ng/mL，表明CTLA4-Ig蛋白在轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚組織中呈分泌性表達(dá)，并具備較強(qiáng)的分泌活性。 在第三部分，利用本課題制備的轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚，以小鼠→大鼠異種皮膚移植為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停芯苛巳薈TLA4-Ig于移植皮膚的表達(dá)對其在異種創(chuàng)面的存活及對受體免疫功能的影響。此外，本實(shí)驗(yàn)還首次以糖尿病大鼠為受體開展異種皮膚移植實(shí)驗(yàn)研究。 三、研究結(jié)論

16、1.本課題研究建立了有效的轉(zhuǎn)基因小鼠制備技術(shù)體系，且通過方法學(xué)研究表明，雙原核顯微注射可有效提高轉(zhuǎn)基因小鼠的總體研制效率，目前未見有相關(guān)報道。 2.首次建立了皮膚靶向、高效、穩(wěn)定表達(dá)人CTLA4-Ig分子的轉(zhuǎn)基因小鼠品系。基因表達(dá)分析表明，CTLA4-Ig實(shí)現(xiàn)了在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的皮膚特異性高水平表達(dá)，其表達(dá)水平與內(nèi)參基因相當(dāng)甚至更高；以組成性表達(dá)的內(nèi)參基因?yàn)閰⒄?，CTLA4-Ig的表達(dá)在轉(zhuǎn)基因小鼠傳代和個體發(fā)育中保持相對穩(wěn)定；通

17、過ELISA在轉(zhuǎn)基因小鼠血清中檢測到了較高濃度的人CTLA4-Ig分子，表明轉(zhuǎn)基因在皮膚組織中呈分泌性表達(dá)。 3.轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚表達(dá)的CTLA4-Ig分子可有效延長其在大鼠創(chuàng)面的存活時間，減少、延緩炎性細(xì)胞浸潤，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，并對受體免疫功能無顯著的全身性影響，表明了所建立的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的有效性，并初步證明了通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)于移植皮膚局部表達(dá)CTLA4-Ig分子可有效、安全的延長其在異種創(chuàng)面的存活。 4.首次以糖尿病大鼠

18、為受體開展異種皮膚移植實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：糖尿病大鼠創(chuàng)面的自然愈合時間顯著長于正常大鼠；CTLA4-Ig轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚在糖尿病大鼠創(chuàng)面的存活時間顯著長于其在正常大鼠創(chuàng)面；糖尿病大鼠對野生型小鼠皮膚的排斥能力及其淋巴細(xì)胞對供體抗原的應(yīng)答能力與正常大鼠無顯著差異。上述結(jié)果表明，高血糖濃度并未顯著影響大鼠對小鼠皮膚的排斥能力，而轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚在糖尿病大鼠創(chuàng)面更長時間的存活可能因創(chuàng)面愈合周期不同所致，提示當(dāng)轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚耐受了最初的急性排斥反應(yīng)后，