基因轉(zhuǎn)移CTLA4-Ig和抗CD40L抗體共同誘導異種胰島移植免疫耐受.pdf

1、免疫排斥反應(yīng)目前仍是胰島移植面臨的主要問題。免疫抑制劑的應(yīng)用，雖然能提高移植物的存活率，但是免疫抑制劑存在致感染、致癌變、致糖尿病的毒副作用，并對胰島β細胞具有破壞作用。誘導免疫耐受是解決排斥反應(yīng)問題的理想方法，也是目前胰島移植研究的熱點。 目的:探討基因轉(zhuǎn)移CTLA4-Ig和抗CD40L抗體共同誘導異種胰島移植免疫耐受的可能性及其機理，為臨床胰島移植誘導免疫耐受提供新的思路和方法。 方法:(1)采用AdEasy同源重組

2、腺病毒載體系統(tǒng)，構(gòu)建攜帶融合基因CTLA4-Ig的重組腺病毒，測定滴度；并用其轉(zhuǎn)染人正常胰島細胞，RT-PCR檢測外源基因CTLA4-Ig的表達。 (2)利用自制的胰島分離裝置消化人胰腺，COBE-2991不連續(xù)密度梯度法純化胰島細胞。 (3)經(jīng)尾靜脈注入鏈脲霉素(60mg/kg體重)，復制糖尿病大鼠模型，隨機分為A、B、C、D四組。A組植入Ad-CTLA4-Ig轉(zhuǎn)染人胰島細胞；B組植入人正常胰島細胞，腹腔注射抗CD40

3、L單克隆抗體；C組植入Ad-CTLA4-Ig轉(zhuǎn)染胰島細胞，腹腔注射抗CD40L單克隆抗體；D組植入人正常胰島細胞，作為對照組。監(jiān)測移植后糖尿病大鼠血糖、生存時間以及移植物存活時間；觀測移植物病理形態(tài)學改變，采用免疫組化方法檢測移植物CTLA4-Ig和Insulin的表達；ELISA方法檢測移植大鼠細胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ的水平變化。 結(jié)果:(1)成功構(gòu)建了攜帶基因CTLA4-Ig的重組腺病毒，滴度為3.5×109

4、efu/ml，并能有效感染人正常胰島細胞，使人胰島細胞表達重組蛋白CTLA4-Ig。 (2)分離純化后平均每條胰腺可獲取數(shù)量為(10.2±2.62)萬IEQ的胰島細胞；胰島細胞活率為(90±8.6)％，純度為(56.8±11.3)％；胰島細胞對胰島素釋放刺激反應(yīng)良好，高糖(300mg/dl)時胰島素的釋放量是低糖(60mg/dl)時的2倍(p＜0.05)。 (3)糖尿病大鼠接受胰島移植后2天血糖開始下降，于移植后4天下降

5、至正常。 (4)胰島移植物存活時間，移植對照組、抗CD40L抗體治療組、Ad-CTLA4-Ig轉(zhuǎn)染組和Ad-CTLA4-Ig和抗CD40L抗體聯(lián)合治療組分別為10±2.1、22±8.2、28±6.5和39±9.3天。 (5)糖尿病胰島移植大鼠生存時間，Ad-CTLA4-Ig和抗CD40L抗體聯(lián)合治療組為65±12.5天，Ad-CTLA4-Ig轉(zhuǎn)染組、抗CD40L抗體治療組和移植對照組分別為48±8.5、35±6.5、21

6、±5.7天；聯(lián)合治療組顯著長于Ad-CTLA4-Ig轉(zhuǎn)染組(P＜0.05)、抗CD40L抗體治療組(P＜0.05)和移植對照組(P＜0.01)；Ad-CTLA4-Ig轉(zhuǎn)染組顯著較抗CD40L抗體治療組和對照組延長(P＜0.05)；抗CD40L抗體治療組又較對照組延長(P＜0.05)。 (6)胰島移植對照組在移植后3天、7天，細胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ的水平均急劇上升，較移植前顯著升高(P＜0.01)；Ad-CTLA

7、4-Ig轉(zhuǎn)染組和CD40L治療組分別在移植后22天和28天時開始上升；而Ad-CTLA4-Ig和CD40L聯(lián)合治療組在移植后各時間段均未見明顯變化。 (7)移植后15天，3個治療組移植物HE染色見成片的胰島細胞團，周圍未見淋巴細胞浸潤，免疫組化染色見胰島細胞棕黃色的Insulin蛋白表達，AdCTLA4-Ig轉(zhuǎn)染組可見胰島細胞棕黃色的CTLA4-Ig蛋白表達。 (8)移植后30天，移植物病理檢查，Ad-CTLA4-Ig和

8、抗CD40L抗體聯(lián)合治療組可見大片的胰島細胞團，未見明顯淋巴細胞浸潤；免疫組化染色可見胰島細胞CTLA4-Ig和Insulin蛋白表達。 結(jié)論:(1)采用AdEasy同源重組腺病毒載體系統(tǒng)，可快速、簡便獲取高滴度的重組腺病毒Ad-CTLA4-Ig。 (2)利用自制的胰島分離裝置和COBE-2991不連續(xù)密度梯度法，可分離純化得到純度高、活性好、功能較佳的胰島細胞。 (3)使用基因轉(zhuǎn)移CTLA4-Ig阻斷B7/CD