銅對黃顙魚和矛尾復(fù)蝦虎魚脂類代謝的影響及機理研究.pdf

1、銅是魚類必需的微量元素之一，具有多種生理功能，但同時它也是一種重金屬元素，過量會對魚類產(chǎn)生毒副作用。目前的研究主要關(guān)注銅對魚類生長性能、銅富集、組織結(jié)構(gòu)病變以及氧化應(yīng)激等方面的影響，而關(guān)于銅影響魚類脂肪沉積及脂類代謝的研究報道極為缺乏。本文以矛尾復(fù)蝦虎魚和黃顙魚為研究對象，首先克隆得到了一些脂類代謝相關(guān)基因的cDNA序列，并對其做了組織表達分析。然后，我們研究了水體銅暴露和飼料銅水平（缺乏和過量）對這兩種魚脂類代謝的影響及其機理。主要結(jié)

2、果如下:
　　1.黃顙魚和矛尾復(fù)蝦虎魚脂類代謝基因的分子克隆及組織表達分析
　　利用簡并引物，采用RT-PCR和RACE技術(shù)從黃顙魚中獲得了兩種激素敏感脂酶(HSL)基因的cDNA全長，命名為HSL1和HSL2。其長度分別為2739和2629bp，分別編碼679和813個氨基酸，同源性為57.7％。進化分析結(jié)果表明，這兩種HSL基因?qū)倥韵低椿?，可能產(chǎn)生于硬骨魚類特有的基因組倍增事件。HSL1和HSL2在該魚的各組織（肝臟

3、、心臟、脾臟、腎臟、肌肉、鰓、腸道、腦和腸系膜脂肪組織）以及各發(fā)育階段（稚魚期、幼魚期、亞成魚期和成魚期）均有表達，但呈現(xiàn)出不同的組織及發(fā)育表達模式，可能意味著它們具有不同的生理功能。
　　利用簡并引物和RT-PCR技術(shù)從矛尾復(fù)蝦虎魚中獲得了15個脂類代謝相關(guān)基因的cDNA片段，包括G6PD、6PGD、ME、ICDH、FAS、ACCα、ACCβ、LPL、ATGL、HSL1、HSL2、CPTⅠA、SREBP-1、PPARα和PPAR

4、γ。這些基因與人、小鼠、爪蟾及斑馬魚的氨基酸同源性為54.6％～93.1％。進化分析進一步確定了這些基因并證明了矛尾復(fù)蝦虎魚的進化地位。所有這15個基因在矛尾復(fù)蝦虎魚的各組織（包括肝臟、肌肉、脾臟、腦、腸道、心臟及鰓）中均檢測到，只是表達量有所差異。
　　2.水體銅暴露對矛尾復(fù)蝦虎魚生長、銅富集及肝臟脂類代謝的影響
　　為了研究水體銅暴露對矛尾復(fù)蝦虎魚生長、銅富集及脂類代謝的影響，將矛尾復(fù)蝦虎魚分別暴露于3個銅濃度(對照、5

5、7μg Cu/L和118μg Cu/L)的水體中30d。結(jié)果顯示，隨著水體銅濃度的上升，矛尾復(fù)蝦虎魚生長性能下降，但肝體比(HSI)、臟體比(VSI)和肝臟脂肪含量均升高。油紅O染色結(jié)果顯示，銅暴露組魚的肝臟呈現(xiàn)大量的脂肪變性。銅暴露增加了肝臟6PGD、G6PD和ME的活性，但對FAS、ICDH和CPTⅠ的活性沒有顯著影響。此外，銅暴露增加了肝臟、鰓和胃腸道的銅含量，而對肌肉和脾臟沒有顯著影響。本研究證明了水體銅暴露能增強矛尾復(fù)蝦虎魚的

6、脂類合成代謝，從而導致其肝臟脂肪沉積增加。
　　3.水體銅暴露對黃顙魚脂類代謝的影響
　　為了研究水體銅暴露對黃顙魚肝臟和脂肪組織中脂類代謝的影響及其機理，將黃顙魚分別暴露于4個銅濃度(對照、24μg Cu/L、71μg Cu/L和118μg Cu/L)的水體中6周。結(jié)果顯示，水體銅暴露對生長和形態(tài)學參數(shù)（肝體比、臟體比、脂體比和肥滿度）有不利影響。在肝臟中，隨著水體銅濃度的上升，脂肪含量、脂肪生成酶（6PGD、G6PD、M

7、E、ICDH和FAS）的活性，以及6PGD、G6PD、FAS和SREBP-1基因的mRNA表達水平均降低，但LPL的活性及其mRNA表達水平升高。在脂肪組織中，水體高銅濃度下G6PD、ME和LPL的活性以及FAS、LPL和PPARγ基因的表達水平顯著下降。此外，在肝臟和脂肪組織中，轉(zhuǎn)錄因子(SREBP-1和PPARγ)與脂肪生成酶的活性及其編碼基因的mRNA表達水平呈現(xiàn)不同的皮爾森相關(guān)性。因此，本研究表明，銅暴露下肝臟和脂肪組織中脂肪含

8、量的降低是由于脂肪生成酶的活性及其編碼基因的表達水平下降引起的。肝臟和脂肪組織中這些酶和基因的不同反應(yīng)表明了銅暴露下魚類脂類代謝的調(diào)節(jié)具有組織特異性。
　　4.水體銅暴露對黃顙魚肉堿含量、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(CPTⅠ)的動力學性質(zhì)及其表達的影響
　　為了進一步闡明水體銅暴露影響黃顙魚脂類代謝的機理，將黃顙魚分別暴露于4個銅濃度(對照、24μg Cu/L、71μg Cu/L和118μg Cu/L)的水體中6周后，分析對肝臟和肌

9、肉組織中肉堿含量、CPTⅠ的動力學性質(zhì)及四種CPTⅠ構(gòu)型表達水平的影響。結(jié)果顯示，銅暴露增加了肝臟的最大反應(yīng)速率(Vmax)、米氏常數(shù)(Km)以及催化效率(Vmax/Km);在肌肉中，198μgCu/L組的Vmax顯著高于對照組，但Km和Vmax/Km在各處理組間沒有顯著差異。對于肉堿組成，在肝臟中，隨著水體銅濃度的上升，總?cè)鈮A(TC)和脂酰肉堿(AC)的含量以及脂酰肉堿與游離肉堿的比值(AC/FC)升高，但游離肉堿(FC)的含量沒有顯

10、著變化;在肌肉中，隨著水體銅濃度的升高，F(xiàn)C的含量下降，但AC的含量上升，從而導致AC/FC升高。對于CPTⅠ基因的表達，暴露于高銅濃度下(198μg Cu/L)顯著上調(diào)了肝臟中CPTⅠα1a、CPTⅠα1b、CPTⅠα2a，以及肌肉中CPTⅠα1a、CPTⅠα1b、CPTⅠβ的表達水平。此外，CPTⅠ基因的表達水平與肉堿的Km值及CPTⅠ的活性呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。因此，本研究表明，水體銅暴露通過改變?nèi)鈮A組成、CPTⅠ動力學性質(zhì)及不同CP

11、TⅠ亞型的表達水平從而影響了CPTⅠ的活性，進而影響黃顙魚的脂類代謝和脂肪沉積。
　　5.飼料銅缺乏和過量對黃顙魚脂類代謝的影響
　　為了研究飼料銅缺乏和過量對黃顙魚肝臟、肌肉和脂肪組織脂類代謝的影響及其機理，黃顙魚分別飼喂銅含量為0.76（銅缺乏）、4.18（適量銅）和92.45（銅過量）mg/kg的飼料8周。結(jié)果顯示，適量銅組魚的增重率和特定生長率顯著高于銅缺乏和銅過量組。在肝臟中，銅缺乏對銅富集和脂肪含量、脂肪生成酶(

12、6PGD、G6PD和FAS)的活性，以及6PGD、G6PD、FAS、ACCα、PPARγ、LXR、HSL、PPARα和ATGL的mRNA表達水平?jīng)]有顯著影響;但銅過量增加了銅富集、降低了脂肪含量、抑制了FAS的活性，并下調(diào)了6PGD、G6PD、FAS、ACCα、PPARγ、HSL和ATGL的表達水平。在肌肉中，飼料銅水平對脂肪含量、脂肪生成酶的活性及大多數(shù)檢測基因(6PGD、G6PD、FAS、SREBP-1、PPARγ、HSL和LPL)

13、的表達水平?jīng)]有顯著影響。在脂肪組織中，飼料銅缺乏和過量對銅富集和脂肪含量、FAS的活性，以及6PGD、G6PD、FAS、SREBP-1、LXR、PPARα和LPL的表達水平均沒有顯著影響。因此，本實驗表明組織中脂肪含量的改變跟脂類代謝酶的活性及相關(guān)基因表達水平密切相關(guān)。飼料銅水平差異性地影響了肝臟、肌肉和脂肪組織中脂肪生成酶的活性及相關(guān)基因的表達水平，表明不同飼料銅水平下魚類脂類代謝的調(diào)節(jié)具有組織特異性。
　　6.飼料銅缺乏和過量

14、對黃顙魚肉堿含量、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(CPTⅠ)的動力學性質(zhì)及其表達的影響
　　為了進一步闡明飼料銅缺乏和過量影響黃顙魚脂類代謝的機理，黃顙魚分別投喂銅含量為0.76（銅缺乏）、4.18（適量銅）和92.45（銅過量）mg/kg的飼料8周后，分析對肝臟和肌肉組織中肉堿含量、CPTⅠ的動力學性質(zhì)及四種CPTⅠ構(gòu)型表達水平的影響。結(jié)果顯示，在肝臟中，銅缺乏對FC、TC和AC的含量及AC/FC值沒有顯著影響;但銅過量降低了FC、TC和A

15、C的含量及AC/FC值。在肌肉中，飼料銅缺乏和過量對FC、TC和AC的含量沒有顯著影響，但銅過量增加了AC/FC值。與適量銅組相比，銅缺乏對肝臟和肌肉的Vmax、Km以及Vmax/Km都沒有顯著影響;但是，銅過量組肝臟的Vmax和Vmax/Km顯著降低，而肌肉的Vmax顯著升高。飼料銅含量也影響了肝臟和肌肉中四種CPTⅠ亞型(CPTⅠα1a、 CPTⅠα1b、CPTⅠα2a和CPTⅠβ）的表達水平。此外，CPTⅠ基因的表達水平與肉堿的K