外周血DCCIK對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞系Tca8113的殺傷作用.pdf

1、【研究目的】 1．分別探討舌鱗狀細(xì)胞癌患者外周血DC和CIK分離及體外誘導(dǎo)培養(yǎng)技術(shù)，了解舌癌DC和CIK形態(tài)和表型功能特征。 2．研究共培養(yǎng)DCCIK細(xì)胞的體外擴(kuò)增能力和抗腫瘤活性。 3．建立Tca8113裸鼠移植瘤動(dòng)物模型，進(jìn)一步探討DCCIK細(xì)胞體內(nèi)抗腫瘤能力。 【方法與結(jié)果】 1．舌鱗癌患者外周血樹(shù)突狀細(xì)胞體外培養(yǎng)和鑒定 方法：根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的外周血DC分離培養(yǎng)方法，從lO名舌鱗癌和6

2、名健康人抽取外周血，經(jīng)梯度離心分離外周血單核細(xì)胞，用貼壁培養(yǎng)法獲得貼壁細(xì)胞即DC前體細(xì)胞，以含5％人AB型血漿的RPMIl640完全培養(yǎng)基體外培養(yǎng)，按先后順序加入rhGM-CSF、rhIL-4、Tca8113細(xì)胞裂解液和TNF-a，經(jīng)9天誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得成熟DC。在光鏡和掃描電子顯微鏡下觀察DC細(xì)胞的形態(tài)，計(jì)算培養(yǎng)細(xì)胞的獲得率，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)舌癌組和健康組DC細(xì)胞表面標(biāo)志物CD<,40>、CD<,80>、CD<,83>和HLA-DR表達(dá)情況

3、，觀察腫瘤細(xì)胞裂解液對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞獲得率和標(biāo)志物表達(dá)的影響。結(jié)果：外周血單核細(xì)胞經(jīng)過(guò)9天體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，細(xì)胞體積有所增大，表面形態(tài)由光滑變得形態(tài)不規(guī)整，出現(xiàn)大量毛刺狀或樹(shù)突狀突起，相差顯微鏡、掃描電鏡和細(xì)胞H染色涂片均證實(shí)所獲得的細(xì)胞在形態(tài)上與文獻(xiàn)報(bào)道的DC典型形態(tài)一致。第9天舌癌組和健康組DC獲得率沒(méi)有顯著差異，約9.26％～9.9％，細(xì)胞表面標(biāo)志物CD<,40>、CD<,83>和MHC分子HLA-DR的表達(dá)也沒(méi)有顯著性差異，舌癌組分別為5

4、1.79％、37.19％和65.82％，健康組分別為53.41％、33.20％和69.75％。舌癌組以腫瘤細(xì)胞裂解液刺激后CD<,40>、CD<,83>和HLA—DR的表達(dá)提高，分別為51.79％、37.19％和65.82％，而未加裂解液組分別為28.43％、44.45％和50.48％。 2．DCCIK共培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞系Tca8113的體外殺傷實(shí)驗(yàn) 方法：DC體外誘導(dǎo)培養(yǎng)和腫瘤裂解液沖擊同上述方法，實(shí)驗(yàn)對(duì)象采用舌

5、鱗癌患者外周血。同步進(jìn)行CIK細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，即提取外周血單核細(xì)胞中非貼壁細(xì)胞，用含5％人AB型血漿的RPMIl640懸浮細(xì)胞，加入IFN—γ，培養(yǎng)24小時(shí)后轉(zhuǎn)移至經(jīng)抗CD3單抗包被的培養(yǎng)瓶，加入IL-1β和IL-2繼續(xù)培養(yǎng)，定期換液，連續(xù)培養(yǎng)9天。第9天同時(shí)收獲DC和CIK細(xì)胞，以l:50比例混合培養(yǎng)，第14天獲得DCCIK細(xì)胞。用MTT法檢測(cè)不同效靶比、不同反應(yīng)時(shí)間DCCIK細(xì)胞對(duì)Tca8ll3的抗腫瘤活性，在相同效靶比和反應(yīng)時(shí)間

6、條件下檢測(cè)CIK細(xì)胞與DCCIK細(xì)胞抗腫瘤活性的區(qū)別，檢測(cè)腫瘤裂解液沖擊DC后共培養(yǎng)的DCCIK與未沖擊的DCCIK抗腫瘤活性的區(qū)別。CIK和DCCIK培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞計(jì)數(shù)，了解細(xì)胞擴(kuò)增能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CIK標(biāo)志物CD<,3>CD<,56>的變化。結(jié)果：CIK誘導(dǎo)過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有明顯變化，DC與CIK混合培養(yǎng)后，DC的形態(tài)多樣，可呈梭形或短棒裝。擴(kuò)增能力方面，CIK細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增速度大于同期培養(yǎng)的DC細(xì)胞，第9

7、天CIK細(xì)胞平均增加15.87倍，重新分裝與DC共培養(yǎng)后CIK細(xì)胞平均再擴(kuò)增l2.19倍，擴(kuò)增能力大于單獨(dú)培養(yǎng)的對(duì)照CIK。第9天CIK細(xì)胞的特征標(biāo)志CD3<'+>CD<,s6'+>雙陽(yáng)性細(xì)胞比例9.22％，第14天上升至17.02，共培養(yǎng)的DCCIK第1 4天CD<,3'+>CD<,56'+>雙陽(yáng)性細(xì)胞比例達(dá)57.62％。體外腫瘤殺傷實(shí)驗(yàn)顯示5：1以上效靶比DCCIK．表現(xiàn)出對(duì)Tca8113的抗腫瘤活性，并呈劑量依賴性，5：1、1 O

8、：1、20:1的效靶比反應(yīng)24小時(shí)的殺瘤率分別為36.66％、56.3 5％、69.65％。與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系，DCCIK對(duì)Tca8113的殺瘤率在24、48、72小時(shí)三個(gè)時(shí)間段隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加，分別達(dá)54.82％、60.56％和65.3 5％。DCCIK抗腫瘤活性與CIK的比較，l O：l效靶比作用24小時(shí)，CIK細(xì)胞的殺瘤率51.1l％，裂解液沖擊的DCCIK與普通DCCIK細(xì)胞的殺瘤率分別達(dá)到55.79％和56.1％，與CIK均

9、有顯著性差異，而兩組DCCIK間沒(méi)有顯著性差異。 3．DCCIK細(xì)胞抑制舌鱗癌細(xì)胞系Tca8113移植瘤的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法：舌鱗癌患者外周血DCCIK細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)和腫瘤裂解液沖擊方法同前。研究對(duì)象為BALB／c-nu裸鼠，取24只裸鼠參照文獻(xiàn)中裸鼠Tca8 ll 3移植瘤動(dòng)物模型建立方法，于右腋皮下注射Tca8 ll 3細(xì)胞，24小時(shí)后隨機(jī)分三組，每組8只，A組同部位注射生理鹽水作為對(duì)照組，B組于左腋下注射10倍腫瘤細(xì)胞數(shù)量的

10、DCCIK細(xì)胞，C組于右腋腫瘤種植區(qū)內(nèi)注射等量DCCIK細(xì)胞。取1只裸鼠在右腋下注射等量DCCIK細(xì)胞作為D組對(duì)照，48小時(shí)后處死行注射區(qū)組織學(xué)檢查。觀察各組Tca8113成瘤時(shí)間，于第14天比較各組成瘤率，測(cè)量腫瘤大小，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，觀察4周后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取各組移植瘤做病理檢查。結(jié)果：D組裸鼠腋下注射DCCIK細(xì)胞后，飲食和糞便正常，局部皮膚無(wú)紅腫壞死表現(xiàn)。組織學(xué)檢查，與對(duì)側(cè)正常腋下組織比較，注射DCCIK細(xì)胞后局部未見(jiàn)異種間組

11、織免疫排斥反應(yīng)。觀察期內(nèi)所有動(dòng)物均存活，A、B全部成瘤，C組6只成瘤,A、B、C三組平均成瘤時(shí)間分別為7.63天、9.50天和l2.00天，統(tǒng)計(jì)分析A、C組和A、B組有顯著差異。第14天的成瘤情況，A組8只，B組7只，C組5只，卡方檢驗(yàn)提示三組裸鼠成瘤率沒(méi)有顯著差異。觀察腫瘤的生長(zhǎng)過(guò)程，A組生長(zhǎng)最快，移植瘤平均體積最大，B組生長(zhǎng)曲線與A組近似，C組較為平緩，4周后三組移植瘤平均表面積分別為184.5lmm<'2>，160.59mm<'2

12、>和95.62mm<'2>，統(tǒng)計(jì)顯示A組與C組移植瘤大小具有顯著性差異，A組與B組或B組與C組沒(méi)有差異。移植瘤組織觀察，大體標(biāo)本A組呈多結(jié)節(jié)狀向外凸起，C組體積小，呈單一結(jié)節(jié)。鏡下觀察各組移植瘤見(jiàn)大量腫瘤細(xì)胞，有明顯核分裂像，符合Tca8113移植瘤病理學(xué)特征。B、C組腫瘤內(nèi)組織細(xì)胞形態(tài)與A組未見(jiàn)明顯變化。 【結(jié)論】 1．舌癌患者外周血單核細(xì)胞用rhGM—CSF、rhIL一4和TNF—α進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，可以獲得典型D

13、C細(xì)胞；DC的成熟率、共刺激分子和HLA—DR的表達(dá)與健康組沒(méi)有顯著差異；腫瘤細(xì)胞裂解液的刺激能促進(jìn)舌癌組DC成熟率提高，高表達(dá)共刺激分予和HLA—DR分子。 2．人舌鱗癌患者外周血懸浮生長(zhǎng)的單核細(xì)胞經(jīng)IFN-γ、抗CD<,3>單克隆抗體、IL-1β和IL-2細(xì)胞因子序列誘導(dǎo)后可大量擴(kuò)增富含CD3<,3><'+>CD<,56><'+>雙陽(yáng)性細(xì)胞的CIK異質(zhì)細(xì)胞群；與自體體外誘導(dǎo)成熟的DC共培養(yǎng)后進(jìn)一步促進(jìn)CIK細(xì)胞的擴(kuò)增；經(jīng)腫瘤

14、裂解液沖擊的DC與CIK共培養(yǎng)后，明顯提高CIK細(xì)胞中CD<,3><'+>CD<,56><'+>雙陽(yáng)性細(xì)胞群的比例，并提高DCCIK細(xì)胞的抗腫瘤活性；DCCIK細(xì)胞的腫瘤殺傷能力具有劑量依賴性特點(diǎn)，5:1以上效靶比即能產(chǎn)生抗人舌鱗癌細(xì)胞系Tca8113的效應(yīng)；不管DC細(xì)胞是否經(jīng)過(guò)腫瘤裂解液沖擊，共培養(yǎng)CIK細(xì)胞的腫瘤殺傷活性沒(méi)有顯上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文著性差異。 3．裸鼠局部注射人DCCIK細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生明顯排斥反應(yīng)；Tc