體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞中OPG和RANKL的表達(dá)及其對(duì)牙齒萌出的作用.pdf

1、牙囊組織起源于外胚間充質(zhì)，是包繞成釉器周圍的疏松結(jié)締組織，在牙齒萌出和牙周組織形成中起重要作用，缺乏牙囊的牙齒不能萌出，而單核細(xì)胞在牙囊的聚集以及單核細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞、進(jìn)而吸收牙槽骨、形成牙齒萌出通道是牙齒萌出的關(guān)鍵。這個(gè)過程受許多細(xì)胞因子的調(diào)控，如集落刺激因子-1(CSF-1)、甲狀旁腺相關(guān)蛋白(PTHrP)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、白細(xì)胞介素-1α(IL-1α)、上皮生長(zhǎng)因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)、骨保護(hù)素

2、(OPG)、破骨細(xì)胞分化因子(RANKL)等，這些因子直接或者間接誘導(dǎo)單核細(xì)胞進(jìn)入牙囊。Wise等研究發(fā)現(xiàn)在特定時(shí)期鼠牙囊細(xì)胞中OPG表達(dá)會(huì)下降，實(shí)驗(yàn)證明這種下降是由CSF-1和PTHrP介導(dǎo)的，他們下調(diào)OPG的表達(dá)，使RANKL/OPG比例升高，進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞形成、牙槽骨吸收、牙齒萌出。 對(duì)于牙囊細(xì)胞是否表達(dá)RANKL一直存在爭(zhēng)議，2004年YAO等采用激光捕獲微顯微切割技術(shù)和RT-PCR技術(shù)證明了鼠牙囊細(xì)胞中存在RANKL

3、的表達(dá)，因此推測(cè)牙齒萌出所需的局部環(huán)境中的破骨細(xì)胞形成是由RANKL、OPG、CSF-1和PTHrP等相互作用來調(diào)節(jié)的，但是具體機(jī)制還不清楚，有待于深入研究闡明。 成骨與破骨在骨代謝中是密不可分的，兩者也同時(shí)存在于牙齒萌出這個(gè)特殊的骨代謝過程中，骨形成蛋白-2(BMP-2)作為一種重要的成骨相關(guān)蛋白，在這個(gè)過程中又是如何發(fā)揮作用的呢?對(duì)這方面的研究國(guó)內(nèi)外鮮見報(bào)道。 本實(shí)驗(yàn)通過青少年第三磨牙牙囊細(xì)胞的培養(yǎng)，結(jié)合分子生物學(xué)技

4、術(shù)，首次證明了人牙囊細(xì)胞中存在OPG和RANKL基因的表達(dá)；觀察了CSF-1、PTHrP和BMP-2對(duì)人牙囊細(xì)胞增殖活性、堿性磷酸酶活性的影響；以及對(duì)人牙囊細(xì)胞中OPG和RANKL基因表達(dá)的影響；建立了人牙囊細(xì)胞與人外周血單核細(xì)胞的共培養(yǎng)體系，證實(shí)了人牙囊細(xì)胞表達(dá)的OPG和RANKL在破骨細(xì)胞分化中的作用；結(jié)果有助于闡明牙齒萌出的分子機(jī)制，也為臨床阻生牙的正畸矯治以及牙胚的組織工程研究提供理論基礎(chǔ)。研究?jī)?nèi)容如下： 第一部分：體外

5、人牙囊細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定目的：原代培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞，并鑒定其細(xì)胞來源。方法：取因正畸需要而拔除的牙根尚未發(fā)育完全、牙齒尚未萌出的健康青少年下頜第三磨牙的牙囊，進(jìn)行原代培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)，第5代細(xì)胞進(jìn)行波形絲蛋白和角蛋白免疫組化染色鑒定其細(xì)胞來源。結(jié)果：細(xì)胞形態(tài)呈多形性：有長(zhǎng)梭形、紡錘形、不規(guī)則三角形等，波形絲蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性。結(jié)論：人牙囊細(xì)胞來源于外胚間充質(zhì)，細(xì)胞呈多形性。 第二部分：CSF-1、PTHrP和BMP-2對(duì)

6、體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞生物學(xué)特性的影響目的：檢測(cè)CSF-1、PTHrP和BMP-2對(duì)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞增殖活性和堿性磷酸酶活性的影響。方法：第5代人牙囊細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板上，分別與不同濃度的CSF-1、PTHrP和BMP-2共同孵育，檢測(cè)三種細(xì)胞因子對(duì)人牙囊細(xì)胞的增殖活性和堿性磷酸酶活性的影響。結(jié)果：25ng/mlCSF-1、10ng/mlPTHrP、100ng/mlBMP-2促增殖作用最強(qiáng)，并且第3～5d促增殖效果最顯著。CSF-1和

7、BMP-2可提高人牙囊細(xì)胞的堿性磷酸酶活性，PTHrP降低人牙囊細(xì)胞的堿性磷酸酶活性。結(jié)論：特定濃度下CSF-1、PTHrP和BMP-2對(duì)人牙囊細(xì)胞的增殖均有促進(jìn)作用；CSF-1和BMP-2可刺激人牙囊細(xì)胞向成骨方向分化，PTHrP無此作用。 第三部分：CSF-1、PTHrP和BMP-2對(duì)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞表達(dá)OPG、RANKL的影響目的：研究CSF-1、PTHrP和BMP-2對(duì)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞表達(dá)OPG和RANKL的影響。方

8、法：第5代人牙囊細(xì)胞免疫組化染色，檢測(cè)人牙囊細(xì)胞中OPG和RANKL蛋白的表達(dá)；第5代人牙囊細(xì)胞分別與濃度為25ng/mL的CSF-1和10ng/mL的PTHrP共同孵育0h、0.5h、1h、3h、6h、12h；與濃度為100ng/mL的BMP-2共同孵育0h、1h、3h、6h、12h、18h，夾心ELISA法檢測(cè)上清液中OPG的含量，RT-PCR法檢測(cè)OPG和RANKL基因表達(dá)的變化。結(jié)果：人牙囊細(xì)胞OPG、RANKL免疫組化染色陽性

9、；25ng/mL的CSF-1和10ng/mL的PTHrP可下調(diào)OPG蛋白的分泌，最佳效應(yīng)時(shí)間為1h，上調(diào)RANKL基因的表達(dá)，最佳效應(yīng)時(shí)間為3h，100ng/mL的BMP-2則作用相反，上調(diào)OPG蛋白的分泌，最佳效應(yīng)時(shí)間為12～18h，下調(diào)RANKL基因的表達(dá)，最佳效應(yīng)時(shí)間為6～12h。結(jié)論：人牙囊細(xì)胞存在OPG、RANKL蛋白的表達(dá);CSF-1和PTHrP可降低人牙囊細(xì)胞OPG蛋白的分泌及基因的表達(dá)，同時(shí)可增強(qiáng)RANKL基因的表達(dá)，提

10、高RANKL/OPG的比值，促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成；而BMP-2可增強(qiáng)人牙囊細(xì)胞OPG蛋白分泌和基因表達(dá)，減弱RANKL基因的表達(dá)，降低RANKL/OPG的比值，抑制破骨細(xì)胞的形成。 第四部分：體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞表達(dá)的OPG和RANKL對(duì)破骨細(xì)胞表型分化的影響目的：建立人牙囊細(xì)胞與人外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)體系，研究體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞表達(dá)的OPG和RANKL對(duì)破骨細(xì)胞表型分化的影響。方法：取健康成人外周血分離出單核細(xì)胞，接種于24孔板上

11、，1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，每個(gè)孔內(nèi)放置不銹鋼網(wǎng)架，上面放置一個(gè)長(zhǎng)有人牙囊細(xì)胞的玻片，建立兩種細(xì)胞共培養(yǎng)體系，培養(yǎng)液相通，而細(xì)胞不相接觸，觀察兩種細(xì)胞生長(zhǎng)情況。實(shí)驗(yàn)分七組：A、單核細(xì)胞；B、單核細(xì)胞+牙囊細(xì)胞(接觸)；C、單核細(xì)胞+牙囊細(xì)胞(接觸)+CSF-1+PTHrP；D、單核細(xì)胞+牙囊細(xì)胞(不接觸)；E、單核細(xì)胞+RANKL+CSF-1；F、單核細(xì)胞+RANKL+CSF-1+牙囊細(xì)胞(不接觸)；G、單核細(xì)胞+RANKL+CSF-1+牙囊

12、細(xì)胞(不接觸)+anti-OPG。把每組的細(xì)胞接種到預(yù)置玻片和牙本質(zhì)片的24孔板中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞變化。培養(yǎng)第10d，取出玻片，進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色，計(jì)數(shù)每組TRAP染色陽性細(xì)胞；第14d取出牙本質(zhì)片，掃描電鏡下觀察骨陷窩形成情況。結(jié)果：B、F組可見少量破骨樣細(xì)胞，A、D組無破骨樣細(xì)胞，E組破骨樣細(xì)胞分化最顯著，C、G組破骨樣細(xì)胞較E組略少，但無顯著性差別，與其他各組差別顯著。結(jié)論：建立了培養(yǎng)液相通而細(xì)胞不接觸的人牙囊細(xì)