SEREX方法篩選原發(fā)性肝細(xì)胞癌相關(guān)抗原.pdf

1、背景和目的；原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)早期不易被發(fā)現(xiàn)，然而從免疫學(xué)角度來(lái)說(shuō)腫瘤細(xì)胞的改變可以被免疫細(xì)胞識(shí)別并被免疫系統(tǒng)排斥，從而發(fā)現(xiàn)和診斷HCC。用分子生物學(xué)和免疫學(xué)的方法鑒定出這些改變的基因和蛋白，可能會(huì)為敏感、特異的診斷及免疫治療提供潛在的靶位。HCC發(fā)生發(fā)展的分子基礎(chǔ)之一是多基因表達(dá)，但目前總體上HCC的抗原及其編碼基因還遠(yuǎn)不清楚，對(duì)HCC的抗原研究及以其作為疫苗進(jìn)行免疫治療尚處于不成

2、熟階段，急需尋找新的抗原分子及鑒定其表位。特異性細(xì)胞免疫治療的關(guān)鍵在于尋找合適的腫瘤抗原及其抗原表位，而SEREX(serologicalanalysisofrecombinantcDNAexpressionlibrary)方法是鑒定抗原分子的一種方便且高效的方法，迄今為止，用該方法篩選出的HCC相關(guān)抗原已有三十多種。因此，我們采用SEREX方法，以HCC患者的血清篩選其cDNA文庫(kù)，鑒定出HCC表達(dá)的腫瘤抗原，期望為HCC的診斷和預(yù)后

3、提供新的標(biāo)記物，為HCC疫苗的研制及免疫效果監(jiān)測(cè)打下基礎(chǔ)，并且為探討HCC發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)理提供依據(jù)。 方法；1.將HCC表達(dá)文庫(kù)鋪板，轉(zhuǎn)膜，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)，封閉，同預(yù)吸收血清反應(yīng)后，與二抗反應(yīng)，在二氨聯(lián)苯胺(DAB)的作用下顯色，抗原抗體復(fù)合物處呈現(xiàn)紫藍(lán)色。重復(fù)鋪板和篩選3次，直到獲得單克隆免疫陽(yáng)性重組噬菌體。2.挑取陽(yáng)性噬菌斑，噬菌斑塊于SM緩沖液中4℃保存。陽(yáng)性克隆經(jīng)過(guò)體內(nèi)剪切，成

4、為pBluescriptSK-噬菌粒。3.提取質(zhì)粒，經(jīng)XhoⅠ、EcoRⅠ雙酶切初步鑒定插入片段的大小。4.質(zhì)粒以T3、T7通用引物測(cè)序，序列結(jié)果用BLAST軟件搜索GenBank，進(jìn)行比對(duì)分析。 結(jié)果；經(jīng)過(guò)三輪篩選，從5×105pfu的文庫(kù)中篩得81個(gè)陽(yáng)性克隆，其插入片段的大小約在250bp-2300bp之間，平均為1100bp。它們代表57個(gè)不同的cDNA序列，其中41個(gè)為已知功能的基因，16個(gè)為功能未知基因。在已知功能的基