精氨酸加壓素調控AQP4介導星形膠質細胞水通透性的信號轉導機制的研究.pdf

1、目的：構建綠色熒光蛋白（GFP）標識的水通道蛋白-4（AQP4）及其突變體示蹤系統(tǒng)，利用激光共聚焦技術，建立表達AQP4及其突變體的大鼠星形膠質細胞水通透性的評價系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)探討精氨酸加壓素（AVP）對AQP4水通透性的調控及信號轉導機制。
　　 方法：依據大鼠AQP4-M23的cDNA序列和質粒pEGFP-C1多克隆位點（MCS）的特點設計引入合適的內切酶序列的引物，通過RT-PCR法獲取AQP4-M23的DNA序列，凝

2、膠電泳鑒定；利用pMD○R20-T克隆載體通過T-A克隆擴增AQP4-M23，并進行基因測序鑒定；酶切T-A克隆所得AQP4-M23與pEGFP-C1質粒進行連接反應，完成pEGFP-C1-AQP4-M23的構建，鑒定正確后，擴增、提取純化融合質粒。設計將AQP4-M23的第111位和180位的絲氨酸突變?yōu)楸彼岬囊飳?，利用Muta-directTM定點突變試劑盒通過PCR技術使特定位點突變，構建pEGFP-C1-S111A-AQP4

3、-M23和pEGFP-C1-S180A-AQP4-M23兩種含突變位點的融合質粒。
　　 水通透性測定：依據優(yōu)化實驗結果，將構建的融合質粒瞬時轉染不表達AQP4的CTX-TNA2星形膠質細胞，37℃、5％C02、完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h使目的蛋白表達。利用激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）成像技術記錄GFP熒光圖像，以確定細胞表達與不表達目的蛋白，然后記錄不同干預條件下，鈣黃綠素熒光強度的變化，利用LSCM的脫機圖像分析軟件LAS A

4、F Lite和免費圖像處理軟件Image J l。42對脫機圖像進行處理，分析GFP在細胞上的分布，觀察V1aR激動擠Arg8-Vasoticin對AQP4定位的影響。選擇表達目的蛋白的細胞及其周圍不表達目的蛋白的細胞作為觀察對象，分析換低滲環(huán)境前后不同時間點和不同干預條件下Calcein熒光強度的變化，取PBS由等滲液到換成低滲液即刻及其后10s內的熒光變化曲線作為分析對象，計算熒光強度隨時間變化的速度，即時間導數τ，代表細胞水腫的速

5、度，本實驗中以-τ表細胞膜對水的通透性的大小，以判斷不同干預條件下AQP4-M23及其突變體對水的通透性。
　　 結果：
　　 1.基于GFP標識的AQP4-M23及其突變體示蹤系統(tǒng)的建立
　　 以SD大鼠腦組織總RNA為模板，利用自行設計的包含相應酶切位點序列的引物進行RT-PCR擴增AQP4-M23產物的凝膠電泳凝膠見大小正確的條帶，T-A克隆擴增目的基因后測序，比對基因測序結果和基因庫數據可見測序圖中序號為

6、24-929的堿基共計906個堿基和AQP4-M23序列完全一致，并在序列前后正確引入了內切酶HindⅢ和XbaⅠ酶切位點的序列，通過RT-PCR技術準確獲取了AQP4-M23全長序列。利用基因重組技術連接真核表達質粒pEGFP-C1和所獲得的含有合適酶切位點的AQP4-M23序列后，酶切證實目的基因（AQP4-M23）以正確方式插入質粒pEGFP-C1的MCS中。以融合質粒pEGFP-C1-AQP4-M23為模板，設計引物改變相應突變

7、位點堿基通過PCR技術分別實現S111和S180兩個氨基酸殘基對應堿基的突變，基因測序圖譜分別示S111對應的堿基AGC突變?yōu)镚CC、S180對應的堿基TCC突變?yōu)镚CC。RT-PCR證實，CTX-TNA2星形膠質細胞系不表達內源性AQP4。LSCM掃描結果示，GFP標記于AQP4-M23的氨基端，不影響AQP4-M23定位在胞膜上，融合蛋白在細胞膜上表達，均勻分布，胞漿內僅痕量表達；S111和S180突變?yōu)楸彼岷蟛挥绊懲蛔凅w在細胞膜

8、上的定位。下調儀器增益可消除GFP的熒光對鈣黃綠素熒光強度測量的影響。表達了GFP標記的AQP4-M23的CTX-TNA2細胞，隨蛋白表達量的增加，細胞膜對水的通透性增加，GFP熒光強度增加到一定程度后，進一步增加時，細胞膜對水的通透性未出現明顯增加。
　　 2.AVP對AQP4-M23水通透性的影響
　　 本實驗中Arg8-vasotocin未改變轉染了pEGFP-C1-AQP4-M23融合質粒的CTX-TNA2星形膠

9、質細胞GFP熒光強度及其在細胞膜及胞漿內分布。表達AQP4-M23的CTX-TNA2細胞對水的通透性明顯增加，達5倍左右（P<0。Ol）；Arg8-vasotocin對不表達AQP4-M23的CTX-TNA2細胞對水的通透性無影響（P＞0。05）：Arg8-vasotocin處理使表達AQP4-M23的CTX-TNA2細胞對的水通透性進一步增加（P<0。01）；在Arg8-vasotocin處理前先加CaMKⅡ抑制劑KN-62預處理，可

10、阻斷Arg8-vasotocin的這種作用，在Arg8-vasotocin處理前先加PKC抑制劑BISI預處理，使表達AQP4-M23的CTX-TNA2細胞對的水通透性略有增加，但無統(tǒng)計學意義（P>0。05）。
　　 3.S111突變對AQP4-M23水通透性及AVP干預的影響
　　 和表達了AQP4-M23的CTX-TNA2細胞相比，AQP4-M23第111位的絲氨酸突變?yōu)楸彼岷髮λ耐ㄍ感詻]有明顯的影響；Arg8-

11、vasotocin處理不能使表達S111A-AQP4-M23的CTX-TNA2細胞對的水通透性進一步增加，BISI預處理對表達S111A-AQP4-M23的CTX-TNA2細胞對水的通透性無明顯影響（P>0。05）。
　　 4.S180突變對AQP4-M23水通透性及AVP干預的影響
　　 和表達了AQP4-M23的CTX-TNA2細胞相比，AQP4-M23第180位的絲氨酸突變?yōu)楸彼岷髮λ耐ㄍ感詻]有明顯的影響；Ar

12、g8-vasotocin處理仍可使表達S180A-AQP4-M23的CTX-TNA2細胞對的水通透性進一步增加（P<0。Ol），KN-62預處理仍可阻斷Arg8-vasotocin的這種作用（P<0。05）。
　　 結論：本實驗成功構建GFP標識的AQP4及其突變體示蹤系統(tǒng)，建立了表達AQP4及其突變體的大鼠星形膠質細胞水通透性的評價系統(tǒng)，AQP4可使星形膠質細胞對水的通透性明顯增加，AVP可通過激活V1aR增加AQP4對水的通