高遷移率族蛋白1介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性上升的機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　 膿毒癥尤其嚴(yán)重膿毒癥仍是面臨的主要健康問題之一，是重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)病人的首要死亡原因。內(nèi)皮細(xì)胞激活、功能障礙和損傷是嚴(yán)重膿毒癥及多器官功能障礙綜合征(MODS)的重要特征。內(nèi)皮通透性增高所致微血管滲漏是嚴(yán)重膿毒癥和MODS的重要病理生理。最近發(fā)現(xiàn)，高遷移率族蛋白1(high mobility group box1，HMGB1)是一種晚期重要炎癥因子，參與膿毒癥病理過程。本實(shí)驗(yàn)擬研究晚期炎癥因子高遷移率族蛋白1

2、對內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性的影響及其作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 (1)體外分離培養(yǎng)人原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)，鏡下觀察HUVEC細(xì)胞形態(tài)特征，免疫組織化學(xué)方法檢測HUYEC胞漿Ⅷ因子的表達(dá)。
　　 (2)用200 ng/ml的高遷移率族蛋白1于不同時間點(diǎn)(6 h，12 h，24 h和48 h)刺激HUVEC以及不同劑量(50ng/

3、ml，100 ng/ml，200 ng/ml和400 ng/ml)的高遷移率族蛋白1刺激HUVEC24h，采用Transwell chamber彌散模型，以熒光光譜儀測定異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的葡聚糖(Dextran)透過Transwell小室的熒光強(qiáng)度，通透性系數(shù)表示人血管內(nèi)皮細(xì)胞單層的通透性大??；
　　 (3)流式細(xì)胞術(shù)檢測HMGB1刺激內(nèi)皮細(xì)胞24h后內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡情況。HMGB1刺激融合生長的內(nèi)皮細(xì)胞單層，熒光顯

4、微鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞黏附連接蛋白(VE-cadherin)的形態(tài)分布以及蛋白免疫印跡法檢測內(nèi)皮細(xì)胞VE-cadherin總蛋白和膜蛋白的表達(dá)變化情況。
　　 (4)分別用RT-PCR法和蛋白免疫印跡法檢測HMGB1刺激內(nèi)皮細(xì)胞前后TLR2，TLR4和RAGE的mRNA和蛋白表達(dá)變化，流式細(xì)胞術(shù)測定HMGB1刺激內(nèi)皮細(xì)胞前后細(xì)胞膜表面Toll樣受體2(Toll Like Receptor2，TLR2)，Toll樣受體4(Toll Li

5、keReceptor4，TLR4)和晚期糖基化終產(chǎn)物受體(Receptor for advanced glycation endproducts，RAGE)的變化情況。
　　 (5)分別用TLR2，TLR4和RAGE特異性抗體和特異性siRNA抑制TLR2，TLR4和RAGE，再檢測HMGB1刺激內(nèi)皮細(xì)胞前后血管內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性的變化。
　　 (6)分別用MAPK抑制劑(U0126；SB203580；SP600125)

6、，蛋白激酶C抑制劑(Ro-31-8425)和Src絡(luò)氨酸激酶抑制劑(PP2)抑制特異蛋白激酶活性，再檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性的變化。
　　 結(jié)果：
　　 (1)顯微鏡下人原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞呈橢圓形或梭形，鋪路石狀鑲嵌排列，胞漿表達(dá)Ⅷ因子呈陽性，具有典型的內(nèi)皮細(xì)胞特征；
　　 (2)與對照組相比，HMGB1誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性增高，且內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性隨HMGB1劑量增大而增高。HMGB1作用24h后內(nèi)皮細(xì)胞單

7、層通透性升高達(dá)到最大，在48h后內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性又降低。
　　 (3)相比較于對照組，HMGB1刺激內(nèi)皮細(xì)胞24h后，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡沒有增加。HMGB1刺激內(nèi)皮細(xì)胞后，內(nèi)皮細(xì)胞VE-cadherin排列紊亂模糊、失去連續(xù)性、片段化分布于細(xì)胞邊界；上述損傷性變化在HMGB1作用24h最明顯。蛋白免疫印跡法顯示HMGB1刺激內(nèi)皮細(xì)胞后內(nèi)皮細(xì)胞膜上VE-cadherin蛋白減少，但是HMGB1刺激內(nèi)皮細(xì)胞前后VE-cadherin蛋白

8、總量并沒有變化。
　　 (4)HMGB1刺激內(nèi)皮細(xì)胞6 h后TLR2和TLR4 mRNA水平?jīng)]有變化，但是RAGEmRNA轉(zhuǎn)錄水平上升。HMGB1刺激內(nèi)皮細(xì)胞12 h后，RAGE蛋白表達(dá)開始上升，至24h達(dá)到最高，在48 h后RAGE蛋白表達(dá)又下降。TLR2蛋白表達(dá)水平比較低，在HMGB1刺激內(nèi)皮細(xì)胞后TLR2和TLR4蛋白表達(dá)沒有上升。流式細(xì)胞術(shù)表明HMGB1刺激內(nèi)皮細(xì)胞24 h后，TLR2、TLR4和RAGE在內(nèi)皮細(xì)胞膜上含

9、量都上升。
　　 (5)TLR2，TLR4特異性抗體和siRNA不能抑制HMGB1誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞層通透性升高，而RAGE特異性抗體和siRNA明顯抑制了HMGB1誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞層通透性升高。
　　 (6)MAPK抑制劑(U0126，SB203580，SP600125)，蛋白激酶C抑制劑(Ro-31-8425)不能抑制HMGB1誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞層通透性升高，Src酪氨酸激酶抑制劑(PP2)顯著抑制HMGB1誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞層通