急性高眼壓介導(dǎo)視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞AQP4內(nèi)化及其機(jī)制研究.pdf

1、水通道蛋白-4（AQP4）是腦和視網(wǎng)膜中最主要的一種水通道蛋白。在視網(wǎng)膜中，AQP4位于膠質(zhì)細(xì)胞（包括星形膠質(zhì)細(xì)胞及Müller細(xì)胞）的特殊膜域，使水沿著靜水壓和滲透壓的梯度從高向低流動(dòng)。國(guó)內(nèi)外的研究資料表明，AQP4不僅與正常視網(wǎng)膜中水、電解質(zhì)、滲透壓平衡的維持和眼內(nèi)壓的調(diào)節(jié)有關(guān)，而且與疾病狀態(tài)下視網(wǎng)膜水腫時(shí)水的異常轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān);在高眼壓/再灌注損傷大鼠模型中，不僅視網(wǎng)膜內(nèi)AQP4的表達(dá)量可出現(xiàn)異常，而且其在視網(wǎng)膜中的定位也可發(fā)生改變。上

2、述結(jié)果提示，高眼壓/再灌注損傷可導(dǎo)致AQP4的定量及定位的異常，但是引起這些異常的機(jī)制仍不清楚。
　　 有資料顯示，包括AQP4在內(nèi)的部分膜蛋白可發(fā)生內(nèi)化(internalization)—即其亞細(xì)胞定位發(fā)生改變，并同時(shí)伴隨其功能的變化，而且內(nèi)化入胞的蛋白質(zhì)也可分選(sorting)至溶酶體，在此過(guò)程中他們被水解酶完全降解;目前，關(guān)于高眼壓及再灌注損傷所致AQP4的改變是否與其內(nèi)化及溶酶體內(nèi)降解有關(guān)，尚未見報(bào)道。
　　

3、因此，本課題從在體及離體兩方面展開研究，通過(guò)大鼠模型研究急性高眼壓(AOH)及再灌注損傷條件下AQP4內(nèi)化/溶酶體分選的規(guī)律，并通過(guò)離體實(shí)驗(yàn)研究AQP4內(nèi)化/溶酶體降解的機(jī)制。本研究結(jié)果將闡明高眼壓視網(wǎng)膜損傷的分子機(jī)制，并可為視網(wǎng)膜水腫防治的新藥開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 研究目的：
　　 1.研究急性高眼壓/再灌注損傷模型介導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜AQP4內(nèi)化/溶酶體分選的發(fā)生及其時(shí)空變化規(guī)律，并探討其與視網(wǎng)膜水腫發(fā)生之間的關(guān)系。<

4、br>　　 2.通過(guò)加壓細(xì)胞培養(yǎng)，研究壓力因素對(duì)AQP4內(nèi)化/溶酶體降解的影響，對(duì)高眼壓條件下視網(wǎng)膜AQP4內(nèi)化/溶酶體分選的機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　 研究?jī)?nèi)容和方法：
　　 1.成年健康雌性SD(Sprague-Dawley)大鼠180只，隨機(jī)分為高眼壓組與再灌注組用于造模。大鼠麻醉后固定于立體定位儀上，采用左眼前房灌注加壓法制作110 mm Hg急性高眼壓大鼠模型;高眼壓組根據(jù)高眼壓維持時(shí)間分為高眼壓5、10、30

5、、60、90 min等5組;再灌注組在維持高眼壓狀態(tài)60 min后，根據(jù)再灌時(shí)間分為再灌注0、1、2、4、8、12 h等組;每組大鼠的右眼平均分為兩部分，一半作為正常對(duì)照組，另一半作為假手術(shù)組，只穿刺，不加壓，以排除操作過(guò)程對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。造模結(jié)束后，每組選取6只大鼠，剝離視網(wǎng)膜后采用干-濕重法檢測(cè)各組視網(wǎng)膜組織含水量的變化;剩余的大鼠經(jīng)過(guò)灌流固定后，進(jìn)行視網(wǎng)膜切片及鋪片，使用HE染色觀察各組視網(wǎng)膜（切片）病理改變;應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)方

6、法鑒定視網(wǎng)膜（切片）中AQP4陽(yáng)性細(xì)胞的種類、檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜（切片/鋪片）中AQP4與早期內(nèi)涵體標(biāo)記物EEA1、晚期內(nèi)涵體標(biāo)記物甘露糖-6-磷酸受體(MPR)及溶酶體相關(guān)膜蛋白-1(LAMP1)的共表達(dá)，計(jì)數(shù)各組視網(wǎng)膜中AQP4陽(yáng)性細(xì)胞及AQP4/EEA1、AQP4/LAMP1共表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量，并計(jì)算及比較其比例。
　　 2.體外培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞（加入層粘連蛋白，即laminin蛋白）及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染AQP4的CHO細(xì)胞，使

7、用免疫熒光染色方法檢測(cè)兩種細(xì)胞AQP4的表達(dá);將每種細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、加壓組。對(duì)照組不做任何處理，加壓組在0.02 MPa壓力條件下培養(yǎng)3h，應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)方法檢測(cè)各組細(xì)胞AQP4/EEA1、AQP4/MPR及AQP4/LAMP1的共表達(dá);使用鈣黃綠素淬滅法(Calcein-quenching method)檢測(cè)各組細(xì)胞水通透性的改變。
　　 結(jié)果：
　　 1.高眼壓10 min后，各實(shí)驗(yàn)組大鼠視網(wǎng)膜含水量均較對(duì)照組

8、增加(P＜0.05)，再灌注1h組視網(wǎng)膜含水量達(dá)到峰值92.76％，再灌注2h至4h短暫下降至86.33％(P＜0.05)，其后繼續(xù)上升;HE染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜層次結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂，呈水腫表現(xiàn);免疫熒光雙標(biāo)記結(jié)果顯示在正常視網(wǎng)膜中，AQP4+/GFAP+的星形膠質(zhì)細(xì)胞位于神經(jīng)纖維層和節(jié)細(xì)胞層，AQP4+/GS+(Glutamine synthetase)的Müller細(xì)胞胞體位于內(nèi)核層。在高眼壓5、10、30、60及90 min組及再

9、灌注0-12h大鼠視網(wǎng)膜GCL（及INL）內(nèi)，均可見AQP4/EEA1的共表達(dá)，并且AQP4/EEA1共表達(dá)細(xì)胞在高眼壓60 min達(dá)峰值(72.97％±9.89％，P＜0.05);在高眼壓90 min及再灌注12h未見AQP4/MPR的共表達(dá)，其它時(shí)間點(diǎn)均觀察到AQP4/MPR的共表達(dá);在高眼壓后再灌注1、2、4、8、12h，可見到AQP4/LAMP1的共表達(dá)，再灌注4h，膠質(zhì)細(xì)胞中AQP4/LAMP1共表達(dá)細(xì)胞的比例達(dá)到最大值（55

10、.60％±13.03％，與相鄰上一時(shí)間點(diǎn)相比，P＜0.05），此后共表達(dá)細(xì)胞比例逐漸減少。
　　 2.原代培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞，在20 nM的層粘連蛋白（laminin蛋白）孵育條件下，其AQP4呈簇狀表達(dá)于細(xì)胞膜上;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染AQP4的CHO(Chinese hamster ovary，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢癌)細(xì)胞，其AQP4呈線形均勻分布于細(xì)胞膜上;加壓處理的膠質(zhì)細(xì)胞及CHO細(xì)胞，可見胞膜上部分AQP4轉(zhuǎn)移入胞質(zhì)內(nèi)，并與EEA1、

11、MPR及LAMP1存在著共表達(dá);與對(duì)照組相比，加壓后的膠質(zhì)細(xì)胞及CHO細(xì)胞水通透性分別下降49.02％及58.81％(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.急性高眼壓及再灌注損傷可導(dǎo)致視網(wǎng)膜發(fā)生水腫，在該過(guò)程中視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞所表達(dá)的AQP4內(nèi)化進(jìn)入早期內(nèi)涵體及晚期內(nèi)涵體，部分內(nèi)化的AQP4可分選至溶酶體內(nèi)降解。AQP4的內(nèi)化/降解可能在視網(wǎng)膜水腫的發(fā)生、發(fā)展中起著作用，并可作為發(fā)展視網(wǎng)膜水腫治療藥物的靶點(diǎn)。