眼內(nèi)注射雷帕霉素促急性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活的機(jī)制.pdf

1、目的：探索雷帕霉素促急性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活的作用機(jī)制。
　　方法：采用健康成年Fischer344大鼠，8-12周齡，共36只。前房灌注生理鹽水法建立急性高眼壓動(dòng)物模型，于術(shù)中維持75mmHg眼壓2小時(shí)。分別設(shè)組如下：正常眼組、對(duì)照組（DMSO）、雷帕霉素組、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Brain-Derived Neurotrophic Factor BDNF）組、BDNF聯(lián)合雷帕霉素組，分別于急性高眼壓3天后玻璃體腔注射相

2、關(guān)藥物，6h后取各組視網(wǎng)膜組織進(jìn)行western blot。分別探測(cè) p70S6K、pAKT(ser473)、pERK、PTEN四個(gè)靶蛋白，其中p70S6K是雷帕霉素發(fā)揮抑制mTORC1藥理作用的觀察指標(biāo)，pAKT(ser473)、pERK蛋白是pS6K-IRS1-PI3K-pERK這一負(fù)反饋通路的觀察指標(biāo)。最后通過(guò)對(duì)可能發(fā)生變化的靶蛋白pERK、PTEN進(jìn)行抑制或激活，取視網(wǎng)膜組織進(jìn)行鋪片免疫組化再次評(píng)估視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)目，進(jìn)一步

3、確認(rèn)相關(guān)作用機(jī)制。數(shù)據(jù)分析多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。抑制pERK后兩樣本比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：（1）急性高眼壓誘導(dǎo)后，與正常眼相比，p70S6K蛋白含量下降（**p<0.01），而眼內(nèi)注射雷帕霉素以及聯(lián)合藥物后與對(duì)照組（DMSO）比較p70S6K蛋白含量明顯減少（**p<0.01），即雷帕霉素可抑制mTORC1活性。（2）急性高眼壓誘導(dǎo)并注射相關(guān)藥物后，雷帕霉素組和聯(lián)合用藥組

4、可提高pAKT(ser473)蛋白含量（*p<0.05），BDNF組pAKT(ser473)蛋白也增加。p70s6k、pAKT(ser473)的變化同時(shí)反映p70S6K-IRS1-PI3K負(fù)反饋信號(hào)通路減弱。（3）雷帕霉素組和聯(lián)合用藥組可顯著增加pERK蛋白的活性（**p<0.01）。（4）通過(guò)進(jìn)一步抑制pERK(U0126)，我們發(fā)現(xiàn)U0126可明顯減少雷帕霉素促視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活的作用（雷帕霉素+U0126組細(xì)胞數(shù)841±56/m