腸黏膜屏障在肝硬化代償期向失代償期轉(zhuǎn)化中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝硬化是一種以肝組織彌漫性纖維化、假小葉和再生結(jié)節(jié)形成為特征的慢性肝病，依據(jù)臨床表現(xiàn)可分為代償期和失代償期，代償期階段肝細(xì)胞功能尚足以維持機(jī)體基本的代謝需要且臨床癥狀多缺乏特異性，因而很少引起患者的重視，待進(jìn)入失代償期階段，健存肝細(xì)胞不能滿足機(jī)體基本的生理需要，則出現(xiàn)以肝細(xì)胞功能減退和門靜脈高壓為主的臨床表現(xiàn)，但兩期界限常不清。采用目前廣泛使用的Child-Pugh分級(jí)方法一般認(rèn)為，Child-PughA級(jí)為肝功能代償期，Child-P

2、ughC級(jí)為肝功能失代償期，而Child-pughB級(jí)為代償與失代償之間的過渡階段。目前臨床對(duì)于肝硬化失代償期的治療仍然限于對(duì)癥治療、改善肝功能及并發(fā)癥的治療幾個(gè)方面。腸源性內(nèi)毒素血癥(IETM)學(xué)說的提出為我們提供了研究肝病發(fā)生機(jī)制新的途徑，我室先前的多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明，IETM是肝炎慢性化和重型化的重要參與因素，同時(shí)IETM在肝性腦病、肝腎綜合征的發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用。我們?cè)O(shè)計(jì)的如下系列實(shí)驗(yàn)，試圖從肝硬化代償期向失代償期轉(zhuǎn)化的角度探討

3、腸黏膜屏障功能減退所引起的腸源性內(nèi)毒素血癥的作用，以提示臨床工作者注重腸道功能的維護(hù)將有助于肝硬化患者預(yù)后的改善。 本研究分三部分。第一部分肝硬化大鼠腸道通透性變化與腸源性內(nèi)毒素血癥之間關(guān)系的研究，共含4個(gè)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)一采用我室創(chuàng)建的復(fù)合因素肝硬化模型，研究大鼠肝硬化時(shí)肝功能分級(jí)與腸源性內(nèi)毒素之間的關(guān)系。結(jié)果表明肝硬化6周及10周大鼠肝功能Child分級(jí)與門靜脈內(nèi)毒素血癥呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.680，P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)二用不

4、同分子量的探針(異硫氰熒光素標(biāo)記的葡聚糖，F(xiàn)ITC-D和Ⅱ型辣根過氧化酶，HRP-Ⅱ)灌胃后直接測(cè)定它們?cè)陂T靜脈血中的含量來研究肝硬化大鼠腸黏膜通透性，并與門靜脈內(nèi)毒素水平進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明不同階段肝硬化大鼠Child-Pugh分級(jí)與門靜脈內(nèi)毒素、FITC-D及HRP-Ⅱ之間用Kendall'stau-b方法比較均呈正相關(guān)關(guān)系，r值分別為0.746、0.599和0.630，P值均小于0.01。提示門靜脈內(nèi)毒素血癥的形成是由于腸黏膜

5、通透性升高引起的。實(shí)驗(yàn)三通過研究肝硬化時(shí)肝臟kupffer細(xì)胞吞噬清除印度墨汁的情況及免疫組化對(duì)kupffer細(xì)胞溶菌酶染色情況，探討肝臟kupffer細(xì)胞在肝硬化體循環(huán)內(nèi)毒素血癥形成中的作用。結(jié)果表明注射印度墨汁24小時(shí)后，肝硬化動(dòng)物肝組織中含墨汁顆粒的細(xì)胞較正常為多，顆粒也較正常大，且多靠近纖維間隔附近，說明肝硬化時(shí)kupffer細(xì)胞對(duì)墨汁吞噬清除能力的減退，但對(duì)kupffer細(xì)胞溶菌酶染色發(fā)現(xiàn)kupffer細(xì)胞總的數(shù)量隨著肝硬化程

6、度的加重而增加。這就提示肝硬化時(shí)kupffer細(xì)胞吞噬功能減退更可能是由于肝硬化肝組織結(jié)構(gòu)改建的結(jié)果，此時(shí)肝臟kupffer細(xì)胞的分泌功能不受明顯影響，這一點(diǎn)更有利于IETM的形成，同時(shí)受體循環(huán)內(nèi)毒素的影響，肝臟kupffer細(xì)胞可分泌大量的TNF-α，進(jìn)而引起細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，造成多器官功能的損害。實(shí)驗(yàn)四通過直接進(jìn)行回腸末端腸內(nèi)容物涂片革蘭氏染色，分析球/桿比值和G+/G-比值，借此判斷回腸末端細(xì)菌增殖和菌群失調(diào)情況。結(jié)果表明，肝硬化

7、大鼠回腸末端存在細(xì)菌增殖和菌群失調(diào)，且以G-桿菌數(shù)量增加為甚，提示在腸黏膜通透性增加的情況下形成細(xì)菌移位的可能。 第二部分通過研究肝硬化大鼠肝、腸組織TNF-α及其mRNA表達(dá)情況，結(jié)合腸組織細(xì)胞凋亡、勻漿髓過氧化物酶(MPO)和組胺水平，探討肝硬化大鼠腸黏膜通透性增高的機(jī)制。包括2個(gè)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)一用TUNEL方法觀察6周及10周肝硬化大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果表明，肝硬化大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡數(shù)量隨肝硬化進(jìn)程的發(fā)展而增加，

8、并與門靜脈內(nèi)毒素水平呈正相關(guān)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)二觀察肝硬化動(dòng)物及肝硬化基礎(chǔ)上尾靜脈注射GdCl3后肝、腸組織TNF-α及其mRNA表達(dá)情況，以及腸組織MPO、組胺的變化情況。結(jié)果表明肝硬化大鼠肝、腸組織中TNF-α及其mRNA表達(dá)均較正常對(duì)照高，但用GdCl3阻斷kupffer細(xì)胞后，肝、腸組織中TNF-α及其mRNA表達(dá)沒有顯著改變，同時(shí)腸組織中MPO、組胺反而升高，腸組織中肥大細(xì)胞數(shù)量較未注射GdCl3組增多，提示肝外單核巨噬系統(tǒng)的激活在肝

9、硬化動(dòng)物腸黏膜通透性的變化中發(fā)揮著重要作用。 第三部分為干預(yù)性研究。因所用模型飲食中鈉鹽含量偏低，故觀察在正常NaCl攝入以及用甘氨酸2周的情況下，腸黏膜通透性變化情況。結(jié)果表明，補(bǔ)充生理需要量的NaCl后腹水發(fā)生率未見增高，且門靜脈內(nèi)毒素水平出現(xiàn)下降，與模型組比較有顯著性差異，因此我們推測(cè)生理需要量的NaCl可能具有保護(hù)腸黏膜屏障的作用。給肝硬化大鼠甘氨酸5g/kg.d灌胃后，其門靜脈內(nèi)毒素水平和探針?biāo)骄@著降低，已接近對(duì)照

10、組大鼠，但肝組織學(xué)改變并不明顯，提示甘氨酸改善肝功能的作用主要是通過保護(hù)腸黏膜屏障功能而實(shí)現(xiàn)的。 通過上述實(shí)驗(yàn)，得出以下結(jié)論：1、實(shí)驗(yàn)研究表明，肝硬化Child-Pugh分級(jí)與門靜脈內(nèi)毒素水平呈正相關(guān)關(guān)系，隨著肝硬化的加重，腸黏膜通透性也逐漸增高，同時(shí)由于回腸末端發(fā)生細(xì)菌增殖與菌群失調(diào)而且G-細(xì)菌占主導(dǎo)地位，也進(jìn)一步加強(qiáng)門靜脈內(nèi)毒素血癥的形成。 2、腸黏膜通透性的增高和腸道菌群易位所引起的腸源性內(nèi)毒素血癥是肝硬化失代償期