基于假病毒的人乳頭瘤病毒小鼠感染模型的建立和初步應(yīng)用.pdf

1、人乳頭瘤病毒(HPV)是引起宮頸癌和尖銳濕疣等疾病的主要因素，如何預(yù)防與治療HPV引起的疾病已成為世界性的課題。HPV預(yù)防性疫苗是目前公認(rèn)的預(yù)防宮頸癌和尖銳濕疣發(fā)生的最有效手段。目前評價HPV疫苗保護性的主要標(biāo)準(zhǔn)是利用HPV假病毒檢測免疫后的血清中是否含有高滴度的中和抗體，而產(chǎn)生的中和抗體是否具有可靠的保護性，這些數(shù)據(jù)在臨床中較少。因此為了證明HPV疫苗是否能有效的預(yù)防人乳頭瘤病毒的感染，需要合適的動物模型對疫苗的效果進行評價。

2、　　 HPV嚴(yán)格的種屬特異性和組織特異性給HPV體外大量培養(yǎng)帶來了極大的困難。研究發(fā)現(xiàn)通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞獲得的HPV假病毒與真病毒具有相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)和感染性，這些特征促使HPV假病毒替代真病毒構(gòu)建動物感染模型。
　　 本研究將經(jīng)過密碼子優(yōu)化的HPV16L1&L2質(zhì)粒和熒光素報告基因表達質(zhì)粒通過PEI方法共轉(zhuǎn)染293FT細胞，72小時后收集裂解細胞，收獲假病毒，利用活體成像儀對假病毒滴度進行測定。在實驗過程中，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒的質(zhì)量及純度

3、直接影響著假病毒的滴度，因此為了保證實驗中生產(chǎn)的假病毒可以滿足檢測需要，本研究通過摸索建立了質(zhì)粒純化及質(zhì)粒質(zhì)量檢測的方法:利用Sepharose6FF和SOURCE30Q柱層析兩步法純化質(zhì)粒，純化后的質(zhì)粒使用Q sepharose TM FastFlow柱層析檢測ocDNA和ccDNA的量和G3000檢測純度。
　　 本研究又對HPV假病毒進行了深入的研究，通過HPV16雙抗夾心系統(tǒng)檢測出利用293FT細胞生產(chǎn)出的HPV16假病

4、毒的濃度為12μg/ml，Western-Blot驗證了假病毒中含有HPVL1&L2蛋白;為了研究HPV假病毒的結(jié)構(gòu)，本文摸索了假病毒的純化方法，確定了Superose6 prep grade柱層析結(jié)合Capto core700兩步純化假病毒的方法，可以達到較好的純化效果，純化后的假病毒在透射電鏡視野下可以觀察到大量直徑為60nm的假病毒顆粒，為假病毒結(jié)構(gòu)解析奠定了基礎(chǔ)。
　　 本研究將HPV16L1&L2和Luc報告基因質(zhì)粒通

5、過PEI共轉(zhuǎn)染293FT細胞，獲得包裹Luc報告基因的HPV16假病毒，利用活體成像儀檢測HPV16假病毒滴度。通過注射醋酸甲羥孕酮使實驗小鼠進入動情間期，壬苯醇醚-9(N-9)化學(xué)損傷其陰道，繼而進行HPV16假病毒攻毒感染并用活體檢測儀檢測小鼠陰道中熒光素酶報告基因的表達情況。成功建立假病毒感染小鼠模型后，本研究又進行了假病毒滴度與最低感染劑量關(guān)系的摸索。為了將此模型應(yīng)用于疫苗保護性檢測，本研究又將HPV16疫苗分三種劑量免疫小鼠，

6、免疫6周后利用HPV16假病毒小鼠感染模型評價HPV16疫苗的保護性，檢測結(jié)果顯示最低劑量(22ng)免疫的小鼠產(chǎn)生的中和抗體完全可以抵御HPV16 PsV的感染，表明了該假病毒感染模型具有較好的實際應(yīng)用性。
　　 綜上所述，本研究成功地摸索出質(zhì)粒純化與質(zhì)控及HPV假病毒顆粒純化的方法，為穩(wěn)定生產(chǎn)HPV假病毒和假病毒的低溫電鏡結(jié)構(gòu)、L1&L2相互作用研究奠定了基礎(chǔ);本研究建立的HPV假病毒小鼠感染模型，為HPV感染干預(yù)研究、致病