αν和β1整合素通過(guò)FAK信號(hào)通路介導(dǎo)了Aβ對(duì)海馬神經(jīng)元的神經(jīng)毒性作用.pdf

1、第一部分
　　 目的:分離培養(yǎng)原代大鼠海馬神經(jīng)元并鑒定其純度，建立Aβ體外神經(jīng)毒性模型。
　　 方法:參照文獻(xiàn)方法分離出生1d SD乳鼠海馬并體外培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞，利用MAP-2免疫染色鑒定神經(jīng)元細(xì)胞純度。不同濃度老化的纖維化Aβ在不同時(shí)間點(diǎn)干預(yù)細(xì)胞，利用MTT比色法測(cè)定其細(xì)胞活性，尋找建立Aβ體外神經(jīng)毒性模型最佳的時(shí)間點(diǎn)和濃度。
　　 結(jié)果:分離后細(xì)胞表現(xiàn)為典型的神經(jīng)元形態(tài)，且經(jīng)MAP-2染色顯示分離細(xì)胞純度＞9

2、5％，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。老化的纖維化Aβ神經(jīng)毒性呈現(xiàn)干預(yù)時(shí)間和濃度依賴性，10 μM Aβ干預(yù)3 d時(shí)細(xì)胞存活率為正常組細(xì)胞存活率的62.3％，處理4 d時(shí)細(xì)胞存活率為正常組細(xì)胞存活率的46.9％。
　　 結(jié)論：參照文獻(xiàn)方法可成功分離并培養(yǎng)原代海馬細(xì)胞。Aβ神經(jīng)毒性呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴性，基于整體實(shí)驗(yàn)考慮，選定10μM Aβ處理海馬神經(jīng)元3 d作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的造模方法。
　　 第二部分
　　 目的:針對(duì)黏著斑激酶（F

3、AK）基因PtK2制備靶向性RNAi慢病毒載體，包裝后測(cè)定病毒濃度并轉(zhuǎn)染大鼠原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞，篩選最佳的感染條件和沉默靶點(diǎn)序列。
　　 方法:依據(jù)siRNA原理設(shè)計(jì)3條大鼠海馬神經(jīng)元FAK基因PtK2的靶向性siRNA序列（S1，S2，S3），經(jīng)酶切、轉(zhuǎn)化、PCR鑒定、陽(yáng)性克隆測(cè)序并慢病毒包裝、測(cè)定病毒濃度。利用熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞GFP表達(dá)測(cè)定不同條件下慢病毒轉(zhuǎn)染效率，Real-time PCR檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞FAK基因表達(dá)

4、，Western blot檢測(cè)FAK蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:成功制備3條靶向性FAK基因PtK2的siRNA慢病毒載體并成功轉(zhuǎn)染到大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中，在感染復(fù)數(shù)為10并加入5μg/ml polybrene條件下慢病毒感染率達(dá)到90％以上。S1、S2、S3均可抑制FAK基因及蛋白的表達(dá)，但S1沉默效果最佳，敲除效率可達(dá)到65％，與正常組比較有均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論:篩選出最佳的感染條件及最佳沉默靶向性序列S1，為后

5、續(xù)研究整合素在AD發(fā)病中的機(jī)制提供了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 第三部分
　　 目的:探討αν和β1整合素介導(dǎo)Aβ對(duì)海馬神經(jīng)元的神經(jīng)毒性作用及可能的作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 1）在10 μM Aβ處理細(xì)胞前，分別用2.5μg/mL和5μg/mL的αν和β1整合素的特異性拮抗劑17E6和 ab58524預(yù)處理細(xì)胞42 h，并通過(guò)MTT、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)、TUNNEL染色等方法觀察各組神經(jīng)元細(xì)胞凋亡變化;

6、　　 2）利用siRNA技術(shù)沉默黏著斑蛋白（FAK），選取最佳的沉默靶序列T1并MOI為10并加入轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑5μg/mL polybrene的條件，轉(zhuǎn)染干預(yù)各組細(xì)胞并觀察各組細(xì)胞的凋亡變化；
　　 3）通過(guò)real-time PCR和Western blotting方法測(cè)定各組細(xì)胞FAK、ρFAK的基因和蛋白表達(dá)情況，探討αν和β1整合素介導(dǎo)Aβ對(duì)元代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元凋亡的可能機(jī)制和信號(hào)通路。
　　 結(jié)果:
　　

7、 1）MTT結(jié)果顯示，17E6和 ab58524均可增加Aβ誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元的存活率，與Aβ處理組比較有顯著差別,而siFAK后，17E6和 ab58524的神經(jīng)保護(hù)作用明顯減弱；
　　 2）TUNEL染色及流失細(xì)胞計(jì)數(shù)法顯示，17E6和 ab58524可抑制Aβ誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元的凋亡，與Aβ處理組比較有顯著差別，而siFAK后，17E6和 ab58524的神經(jīng)保護(hù)作用明顯減弱；
　　 3）Aβ處理均可增加FAK蛋白和基